Dois algoritmos de análise de imagem, "Drosophila MNJ morfometria" e "Drosophila MNJ Bouton morfometria" foram criados, para quantificar automaticamente nove características morfológicas da junção neuromuscular Drosophila (MNJ).
morfologia sináptico é fortemente relacionada com a eficácia sináptica, e em muitos casos defeitos sinapse morfológicas em última análise, conduzir a mau funcionamento sináptica. A junção neuromuscular Drosophila larval (JNM), um modelo bem estabelecido para as sinapses glutamatérgicas, tem sido extensivamente estudado ao longo de décadas. Identificação de mutações que causam defeitos morfológicas JNM revelou um repertório de genes que regulam o desenvolvimento e função sinapse. Muitos deles foram identificados em estudos de grande escala que se concentravam em abordagens qualitativas para detectar anormalidades morfológicas da Drosophila MNJ. A desvantagem de análises qualitativas é que muitos jogadores sutis que contribuem para a morfologia MNJ provável passar desapercebido. Considerando análises quantitativas são necessários para detectar as diferenças morfológicas mais sutis, tais análises ainda não são comumente realizados porque são trabalhoso. Este protocolo descreve em detalhe dois algoritmos de análise de imagem "Drosophila </em> MNJ Morfometria" e 'Drosophila MNJ Bouton Morfometria', disponível como macros Fiji compatíveis, para análise morfométrica quantitativa, precisa e objetiva da Drosophila MNJ. Esta metodologia é desenvolvida para analisar terminais MNJ imunomarcadas com os marcadores mais usados Dlg-1 e . brp Além disso, a sua aplicação mais alargada a outros marcadores tal como HRP, CSP e SYT é apresentada neste protocolo As macros são capazes de avaliar nove características JNM morfológicas:. área JNM, perímetro JNM, Número de boutons, comprimento JNM, JNM ramo mais longo comprimento, o número de ilhas, número de ramos, número de pontos de ramificação e número de zonas activas no terminal JNM.
Distúrbios cognitivos tais como deficiência mental, perturbação do espectro do autismo e esquizofrenia são frequentemente caracterizadas por função anormal sináptica 1, 2, 3. morfologia e função sinapse são firmemente interligados; defeitos morfológicas pode causar mau funcionamento sináptica e, inversamente, a transmissão sináptica aberrante terá impacto maturação sináptica e morfologia 4, 5, 6.
Uma série de organismos modelo têm sido empregadas, a fim de melhor compreender a biologia sinapse e lançar luz sobre como as mudanças sinápticas afetar a função cerebral na saúde e na doença 7, 8, 9. A Drosophila JNM é um extensivamente estudada e bem estabelecido modelo in vivo para sy glutamatérgicanapse biologia 10, 11. Nas últimas décadas, este modelo tem sido utilizado para estudos fisiológicos e focada para o gene, assim como para rastreios genéticos grande escala, com o objectivo de detectar diferenças morfológicas entre NMJs. Em particular, telas para a frente genéticas identificaram muitos reguladores cruciais e mecanismos subjacentes ao desenvolvimento sinapse e funcionar 12, 13, 14, 15, 16. No entanto, a maior parte destes ecrãs baseado na avaliação visual da JNM morfologia terminal e na detecção qualitativa das alterações sinápticas ou de pontuação semi-quantitativo de algumas características morfológicas. Como consequência, anormalidades morfológicas sinápticas em vez sutis que não são óbvias para o olho humano são facilmente perdidas. A fim de ser capaz de detectar de forma abrangente diferenças quantitativas, asJNM tem de ser avaliado de forma precisa por quantificação sistemática dos parâmetros morfológicos de interesse. Medindo características JNM manualmente é trabalhoso, especialmente quando há vários recursos JNM de interesse e / ou ao realizar rastreios genéticos de grande escala. A fim de apoiar multiparamétrica, análise morfológica de alto rendimento e para conseguir a quantificação objectivo, dois macros "Drosophila JNM Morfometria" e "Drosophila JNM Bouton Morfometria" foram desenvolvidos 17. Ambas as macros executar no open source software de análise de imagem Fiji 18, e pode quantificar ambas as imagens confocal e nonconfocal.
Medidas "Drosophila JNM Morfometria" terminais JNM imunocoradas com o disco pós-sináptica marcador grande-1 (Dlg-1) ou a peroxidase de rábano pré-sináptico (HRP), co-marcadas com o marcador bruchpilot zona activa (Brp). Ele quantifica nove Parame morfológicaters (descrito abaixo): área JNM, perímetro JNM, Número de boutons, comprimento JNM, JNM maior comprimento dos ramos, número de ilhas, número de ramos, número de pontos de ramificação e número de zonas activas no terminal sináptico (Figura 1) . Embora um algoritmo para determinar o número de boutons está presente nesta macro, não satisfazer os critérios de precisão 17. Para avaliar correctamente o número de boutons, é necessário usar a macro "Drosophila JNM Bouton Morfometria", o qual é especificamente concebido para quantificar boutons usando preparações JNM imunocoradas pelo anti-sinaptotagmina (SYT) ou proteína de cadeia anti-cisteína (CSP), e co-immunolabeled com Brp. A macro "Drosophila MNJ Bouton Morfometria" quantifica os seguintes parâmetros: número de boutons, área bouton MNJ, comprimento MNJ, MNJ maior comprimento ramo, número de ilhas, número de agências, número de pontos de ramificação e número de zo ativanes (Figura 2).
As macros consistem em 3 sub-macros: (I) "Converter para empilhar" identifica todos os arquivos de imagem disponíveis e cria Z-hyperstacks e projeções de intensidade máxima de ambos os canais. Como saída, esta macro irá gerar dois novos arquivos por sinapse chamado "stack_image_name" e "flatstack_image_name". II) "define ROI" vai abrir todas as imagens de projecção máximos "flatstack_image_name" consecutivamente e apresentá-los com o pedido para definir manualmente a região de interesse (ROI) no qual o terminal sináptico específico de interesse está presente. Isto foi implementado para permitir a exclusão de sinapses de ligação para músculos adjacentes e / ou outros tipos de terminais sinápticos (tais como 1s) que podem estar presentes nas imagens 11. (III) "Analisar" Aplica-se totalmente automatizado de análise para todas as regiões das imagens dentro das fronteiras do ROI. Comoresultado desta etapa, o usuário obterá dois novos arquivos: "Results.txt" onde toda a medida numérica será anotada e um "res_image_name.tif" onde as segmentações imagem subjacente produzidos pela macro será ilustrado. Durante a análise de imagem três estruturas são derivados a partir de cada terminal sináptico: o contorno JNM, o esqueleto JNM, e o número de zonas activas Brp-positivos. O contorno JNM é usada para determinar a área JNM e do seu perímetro e uma bacia de separação subsequente fornece o número de boutons. A partir do esqueleto, cinco características MNJ são deduzidos: o comprimento total MNJ, a soma do comprimento do mais longo caminho contínuo de conectar os dois pontos finais (maior comprimento de ramo), o número de compartimentos desconexos por MNJ (referido como "ilhas" ), o número de ramos, e o número de pontos de ramificação (um ponto de ramificação liga três ou mais ramificações). O número de zonas activas é determinado no Brp-canal por contagemmanchas BRP-positivos. O contorno anotada JNM (linha amarela), o esqueleto JNM (linha azul), e o número de zonas activas Brp-positivas (indicados por focos branco) são mostrados numa imagem de resultados e as medições dos parâmetros são processados para uma (. txt) ficheiro de saída (Figura 3).
Drosophila JNM Morfometria" e 'Drosophila JNM Bouton Morfometria' foram descritos pela primeira e extensivamente validado por Nijhof et ai. 17. Este manuscrito centra-se na metodologia para análise da morfologia JNM usando as macros 'Drosophila JNM Morfometria' e 'Drosophila JNM Bouton Morfometria'. no entanto, antes de análises macro-assistida, dissecações JNM e imunomarcações precisam ser executadas. Estes são passos cruciais, e a combinação de marcadores utilizados para imuno-histoquímica têm de ser adequados para análises macro. Estes passos são brevemente mencionado em sEç ã o 1 do presente protocolo e direccionar o utilizador para referências que descrevem em detalhe os protocolos para executar estes procedimentos.
"Drosophila MNJ Morfometria" e "Drosophila MNJ bouton Morfometria" são ferramentas poderosas para pesquisadores interessados em avaliar a morfologia sinapse. avaliação manual dos parâmetros MNJ é trabalhoso; estima-se que as macros iria salvar um investigador experiente até 15 min / MNJ gasto em segmentação de imagem manual. Com uma a duas dezenas de sinapses avaliadas por condição ou genótipo, este rapidamente resume a uma quantidade considerável de tempo economizado, mesmo em estudos de pequena escala. Ao realizar telas grandes, o ganho do uso de análise de alto rendimento, em comparação com a avaliação manual e quantificação, pode ser imenso. Além do aumento de taxa de transferência, as macros prontamente fornecer análise objectiva; excluem preconceitos pessoais que de outra forma exigem experimentos cegos, bem como diferenças interpessoais que ocorrem quando vários pesquisadores estão envolvidos na análise. Finalmente, as macros fornecem uma uma sensível e precisoANÁLISE das características JNM, permitindo a identificação de reguladores sinápticos que provocam, em vez subtil do que defeitos JNM dramáticas e até agora não apreciado permaneceram pelo olho do investigador. Informações detalhadas sobre procedimentos de validação e os algoritmos utilizados nas macros são encontrados na publicação Nijhof et al. 17.
A funcionalidade das macros foi validado para medir apropriadamente características morfológicas de Drosophila melanogaster NMJs no músculo 4. Subsequentemente, foi demonstrado que as macros foram também adequado para analisar as sinapses em outros músculos neste organismo. É provável que as macros também pode ser utilizado para medir os parâmetros morfológicos de JNM com estrutura semelhante, em outras espécies, incluindo outras espécies de Drosophila e outros insectos. Mesmo NMJs muito distantes em evolução, por exemplo, NMJs de ratinhos, apresentam uma conformação estrutural muito semelhante 29. As macros não foram testados sobre os preparativos MNJ de outras espécies, mas potenciais utilizadores são encorajados a testar as macros para tais fins.
É muito importante que o usuário explora as diferentes auto-limiares e algoritmos para definir / escolher as configurações de macro mais adequados para as imagens. Com estas definições, uma precisão de cerca de 95% é alcançado quando a avaliação macro foi comparada à avaliação manual. Ajustar as configurações de macro para adequadamente segmento 100% das imagens pode ser um procedimento muito trabalhoso ou mesmo impossível. Portanto, a exclusão de imagens não devidamente segmentadas é recomendado se seus números são inferiores a 5%. Evidentemente, se a qualidade das imagens é baixo, as macros irá gerar índices mais elevados de segmentações imagem insatisfatórios. imagens de baixa qualidade irá influenciar semelhante avaliação manual e não pode, portanto, ser associado ao desempenho das macros. No entanto as macros são bastante robustos como eles foram projetados para a imagems gerados em um alto conteúdo microscópio (um microscópio de fluorescência automatizada que permite imagens de um grande número de amostras) 17.
Um ponto crítico é que o utilizador inspecciona visualmente todas as imagens resultados gerados por as macros. Isso permitirá detectar e excluir fotos com segmentação insatisfatória. Na secção 6 deste protocolo, o usuário é guiado como ajustar as configurações de segmentação de imagem correta ao executar a sub-macro "Analisar". Para familiarizar rapidamente com as exigências das macros e como ajustar as configurações de macro uma pasta chamada "Examples_adjusting configurações de macro" está incluído no macro repositório https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a. Treze subpastas, cada um com exemplos de imagens obtidas em diferentes plataformas de microscópio (microscópios elevado teor / confocal / fluorescência) e diferentes colorações imunológicas, são fornecidos. A PDF intitulado “Exemplos guia” está incluído na mesmapasta onde as configurações necessárias para cada exemplo são fornecidos, juntamente com um documento de texto fornecendo os resultados esperados e imagens resultados.
As macros foram projetadas para processar imagens guardadas como .tiff arquivos separados, no entanto alguns usuários podem ter salvo suas imagens em um formato diferente. A seguir https://figshare.com/s/ec634918c027f62f7f2a website 21 contém uma pasta chamada "Drosophila MNJ", onde três arquivos de exemplo (Exemplo 1-3) eo "Guia de exemplos" do documento com instruções detalhadas sobre como importar imagens para o macro se não for armazenado como .tiff arquivos separados também podem ser encontradas na mesma pasta.
Juntos, "Drosophila MNJ Morfometria" e "Drosophila MNJ bouton morfometria" macros quantificar dez diferentes características MNJ: área MNJ, perímetro MNJ, Número de boutons, área bouton MNJ, comprimento MNJ, MNJ mais longo comprimento ramo, Número de islaNDS, número de agências, número de pontos de ramificação e número de zonas ativas. Isto proporciona uma grande vantagem sobre as ferramentas até agora disponíveis, que pode avaliar apenas uma ou algumas características sinápticas 30, 31. Análise quantitativa multiparamétricas tem grande potencial para novas descobertas, por exemplo, para identificar novos reguladores que controlam um até vários aspectos da biologia sinapse. Ele também proporciona a resolução necessária para determinar genes que coregulate exactamente as mesmas características ou sobrepostos JNM e assim são susceptíveis de operar em vias moleculares comuns. Finalmente, ele abre a possibilidade de investigar como diferentes parâmetros sinápticas se correlacionam com o outro em condições não perturbadas 17 e que genes garantir tais correlações morfométricas coordenadas.
Tomados em conjunto, este protocolo ilustra como usar as duas macros "Drosophila MNJ Morfometria" e"Drosophila JNM Bouton Morfometria", que executam a quantificação objectivo e sensível de dez características morfológicas JNM de um modo de elevado rendimento.
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos centro de estoque de Viena Drosophila Resource Center e Bloomington Drosophila (NIH P40OD018537) para fornecer linhagens de Drosophila. Agradecemos Jack Fransen do Microscopical Imaging Center de apoio especializado em imagem. Este estudo foi apoiado por VIDI e concede superior (917-96-346, 912-12-109) da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO), por duas bolsas de doutoramento DCN / Universidade Radboud Medical Center, pela Deficiência Mental rede alemã financiado pelo programa NGFN + do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (BMBF) e pela Gencodys da União Europeia FP7 larga escala integrada de rede (Saúde-241995) para aS. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Immunostainings | Dilution | ||
Mouse anti-discs large 1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | AFFN-DLG1-4D6 | 1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Rabbit anti-horseradish peroxidase | Jackson IR | 323-005-021 | 1/500 |
Rabbit anti-Synaptotagmin | Gift from Hugo Bellen | Jan-00 | |
Mouse anti-Cysteine string protein | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCSP-1(ab49) | 1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit) |
Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Jan-50 |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11029 | 1/200 |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life technologies | A11011 | 1/500 |
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit | ThermoFisher | Z25006 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36930 | |
Material | Company | Catalog number | Comments |
Equipment | |||
Confocal microscope or fluorescence microscope | Leica SP5 | ||
Zeiss Axio imager | |||
Computer | Mac or Pc | ||
Material | Company | Catalog number | Comments |
Software | |||
FIJI |