Un protocole automatisé pour l'analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie
Summary
Nous présentons ici un protocole d'analyse des fibres musculaires rapides, ce qui permet une meilleure qualité de coloration, et ainsi l'acquisition automatique et la quantification des populations de fibres à l'aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement.
Abstract
Quantification des populations de fibres de muscle donne une idée plus précise des effets de la maladie, un traumatisme, et d'autres influences sur la composition du muscle squelettique. Diverses méthodes chronophages ont traditionnellement été utilisées pour étudier les populations de fibres dans de nombreux domaines de recherche. Cependant, récemment mis au point des méthodes immunohistochimiques basées sur l'expression des protéines de chaîne lourde de la myosine fournir une alternative rapide pour identifier les types de fibres multiples dans une seule section. Nous présentons ici un protocole rapide, fiable et reproductible pour une meilleure qualité de coloration, ce qui permet l'acquisition automatique des sections entières et la quantification automatique des populations de fibres avec ImageJ. A cet effet, les muscles squelettiques sont coupés intégrés dans les sections transversales, colorées à l'aide des anticorps chaînes lourdes de myosine avec des anticorps fluorescents secondaires et DAPI pour la coloration des noyaux de cellules. des sections transversales entières sont ensuite balayées automatiquement à l'aide d'un scanner de diapositives pour obtenir composite à haute résolutionimages de l'échantillon entier. Les analyses de la population des fibres sont ensuite effectuées pour quantifier les fibres lentes, intermédiaires et rapides en utilisant une macro automatique pour ImageJ. Nous avons déjà montré que cette méthode permet d'identifier les populations de fibres de manière fiable à un degré de ± 4%. De plus, cette méthode réduit la variabilité inter-utilisateur et le temps par des analyses en utilisant de manière significative la plate-forme open source ImageJ.
Introduction
Composition du muscle squelettique subit de profondes modifications au cours des processus physiologiques tels que le vieillissement 1, 2, 3 exercice, 4, 5, 6, 7 ou processus pathophysiologiques telles que la maladie 8, 9, 10 ou 11 traumatisme. Par conséquent, plusieurs champs de concentré de recherche sur les effets structurels de ces processus pour comprendre les changements fonctionnels. L'un des aspects clés qui déterminent la fonction musculaire est la composition des fibres musculaires. Les fibres musculaires expriment différentes chaînes lourdes de myosine (MHC) des protéines et sont ainsi classés en fibres lentes, intermédiaires, ou rapides 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Physiologiquement, les muscles ont différentes compositions de fibres de muscle selon leur fonction dans le corps. En utilisant typage des fibres musculaires, les populations de fibres peuvent être quantifiés pour identifier l' adaptation à des processus physiologiques ou physiopathologiques 7, 17. Historiquement, un certain nombre de méthodes qui prennent du temps ont été appliquées à la différence entre les types de fibres musculaires. A cet effet, les fibres musculaires ont été classés soit par la réactivité de la myosine ATPase à différents niveaux de pH ou de l'activité enzymatique musculaire. Comme différentes qualités de fibres ne peuvent pas être évalués en une seule section, les sections transversales multiples ont été nécessaires pour identifier toutes les fibres musculaires et de permettre la quantification manuelle 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. En revanche, les publications récentes utilisées immunohistochimie (IHC) contre la protéine de chaîne lourde de myosine pour colorer rapidement plusieurs types de fibres dans une seule des sections transversales. Sur la base des avantages de cette procédure, il est maintenant considéré comme l'étalon-or dans l' analyse de la population des fibres musculaires 19, 23, 24. En utilisant l'amélioration des protocoles de coloration IHC, nous avons récemment pu montrer que l'acquisition automatique des sections entières de croix musculaire et la quantification ultérieure des fibres musculaires automatique est possible en utilisant la plate-forme open source ImageJ. Par rapport à la quantification manuelle, notre procédure a fourni une diminution significative du temps (environ 10% des analyses manuelle) requise par diapositive tout en étant précis à ± 4% 25 </sup>.
L'objectif global de cette méthode est de décrire un guide rapide, fiable, indépendante de l'utilisateur à la quantification des fibres musculaires automatique dans les muscles entiers de rat en utilisant une plate-forme open source. De plus, nous décrivons les modifications potentielles qui permettraient son utilisation pour d'autres spécimens tels que des souris ou des muscles humains.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous démontrons une méthodologie largement accessible pour étudier et quantifier automatiquement les populations de fibres musculaires des sections de rat par immunohistochimie dans un temps de manière efficace. Pour la reproductibilité, nous présentons une étape détaillée par la description de l'étape et les modifications potentielles pour des applications dans d'autres espèces ne sont pas décrites dans cette étude. De plus, nous discutons des avantages de la procédure, les conditions p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par la Fondation pour la recherche Christian Doppler. Nous tenons à remercier Sabine Rauscher de l'imagerie de l'installation de base à l'Université médicale de Vienne, en Autriche pour le soutien tout au long du projet. Les anticorps primaires ont été développés par Schiaffino, S., obtenu à partir de l'études du développement Hybridome Bank, créée par le NICHD du NIH et maintenu à l'Université de l'Iowa, Département de biologie, Iowa City, IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
Riferimenti
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
