Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica
Summary
Aqui, apresentam-se um protocolo para a fibra muscular rápida análises, o que permite melhor qualidade de coloração, e assim aquisição automática e quantificação de populações de fibras utilizando o software ImageJ livremente disponíveis.
Abstract
A quantificação de populações de fibra muscular proporciona um conhecimento mais profundo dos efeitos da doença, trauma, e várias outras influências sobre a composição do músculo esquelético. Vários métodos demorados têm sido tradicionalmente usados para estudar as populações de fibra, em muitos campos da investigação. No entanto, recentemente desenvolvido métodos imuno-histoquímicos com base na expressão da proteína de cadeia pesada de miosina fornecer uma alternativa rápida para identificar vários tipos de fibra em uma única secção. Aqui, nós apresentamos um protocolo rápido, fiável e reprodutível para a melhoria da qualidade de coloração, permitindo a aquisição automática de secções transversais integrais e quantificação automática de populações de fibras com ImageJ. Para esta finalidade, os músculos esqueléticos incorporadas são cortados em secções transversais, coradas utilizando anticorpos da cadeia pesada de miosina com anticorpos fluorescentes secundárias e DAPI para coloração de núcleos de células. secções transversais inteiras são depois digitalizados automaticamente utilizando um scanner de slides para obter compósitos de alta resoluçãoimagens de todo o espécime. análises de população fibra são subsequentemente realizada para quantificar fibras lentas, intermediários e rápido usando um macro automatizado para ImageJ. Foi anteriormente demonstrado que este método pode identificar populações de fibras de forma fiável a um grau de ± 4%. Além disso, este método reduz a variabilidade inter-utilizador e tempo por análises usando significativamente o ImageJ plataforma aberta fonte.
Introduction
Composição músculo esquelético sofre alterações profundas durante processos fisiológicos tais como o envelhecimento de 1, 2, exercício 3, 4, 5, 6, 7, ou processos patofisiológicos, tais como a doença de 8, 9, 10 ou 11 trauma. Assim, vários campos de concentrado de pesquisa sobre os efeitos estruturais destes processos para compreender as mudanças funcionais. Um dos aspectos fundamentais que determinam a função do músculo, é a composição de fibras musculares. As fibras musculares expressar diferentes proteínas de cadeia pesada de miosina (MHC) e são assim classificados em fibras lentas, intermediários, ou rápidos 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Fisiologicamente, os músculos têm composições de fibras musculares diferentes, dependendo da sua função no corpo. Utilizando fibra muscular digitação, populações de fibras pode ser quantificado para identificar adaptação aos processos fisiológicos ou fisiopatológicos 7, 17. Historicamente, um número de métodos demorados foram aplicadas para diferenciar entre tipos de fibras musculares. Para esta finalidade, as fibras musculares foram classificadas tanto por reactividade de ATPase miosina, a vários níveis de pH ou a actividade da enzima muscular. Como diferentes qualidades de fibras não podia ser avaliada num único ponto, múltiplas secções transversais foram necessários para identificar todas as fibras musculares e permitir manual de quantificação 14, 16, 17,= "refex"> 18, 19, 20, 21, 22. Em contraste, publicações recentes utilizados imuno-histoquímica (IHQ) contra a proteína de cadeia pesada de miosina para corar rapidamente vários tipos de fibra em um único secções transversais. Com base nas vantagens do presente processo, considera-se agora o padrão de ouro na análise da população das fibras musculares 19, 23, 24. Usando melhoradas protocolos de coloração IHC, que foram recentemente capaz de mostrar que a aquisição automática de secções transversais músculo integrais e subsequente quantificação da fibra muscular automática é possível utilizar o ImageJ plataforma aberta fonte. Em comparação com o manual de quantificação, o nosso processo proporciona-se um decréscimo significativo no tempo (cerca de 10% de Manual analisa) necessária por lina ao mesmo tempo que uma precisão de ± 4% 25 </s-se>.
O objectivo global do presente método é o de descrever uma guia rápida, de confiança, independente pelo utilizador para quantificação automática da fibra muscular no músculo de rato inteiro utilizando uma plataforma de fonte aberta. Além disso, descreve-se potenciais modificações que permitem a sua utilização para outros espécimes tais como ratinhos ou músculos humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, demonstramos uma metodologia amplamente acessível para estudar e quantificar as populações de fibras de músculo de rato de secções transversais através de imuno-histoquímica de uma maneira eficiente o tempo automaticamente. Para a reprodutibilidade, apresentamos um detalhado passo descrição passo e modificações potenciais para aplicações em outras espécies não descritas neste estudo. Além disso, são discutidas as vantagens do procedimento, pré-requisitos para a função óptima e suas limi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Fundação Christian Doppler Research. Nós gostaríamos de agradecer Sabine Rauscher do Mecanismo de imagem Núcleo da Universidade Médica de Viena, na Áustria para o apoio ao longo do projeto. Os anticorpos primários foram desenvolvidos por Schiaffino, S., obtido a partir do Developmental Studies Hybridoma Bank, criado pelo NICHD da NIH e mantida a The University of Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
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