بروتوكول الآلي السريع لالعضلات تحليل الألياف السكان في الجرذ العضلات المقاطع العرضية عن طريق سلسلة الميوسين الثقيلة المناعية
Summary
هنا، نقدم بروتوكول ليحلل الألياف العضلية السريعة، والذي يسمح تحسين نوعية تلطيخ، والحصول بالتالي التلقائي وتقدير حجم السكان الألياف باستخدام يماغيج البرمجيات المتاحة بحرية.
Abstract
تقدير حجم السكان الألياف العضلية ويوفر أعمق من آثار المرض، والصدمات النفسية، ومختلف التأثيرات الأخرى على تكوين الهيكل العظمي والعضلات. وقد استخدمت أساليب تستغرق وقتا طويلا مختلفة تقليديا لدراسة السكان الألياف في العديد من مجالات البحث. ومع ذلك، وضعت مؤخرا أساليب المناعى على أساس الميوسين السلسلة الثقيلة تعبير البروتين توفير بديل سريع لتحديد أنواع الألياف متعددة في مقطع واحد. هنا، نقدم بروتوكول سريع وموثوق بها وقابلة للتكرار لتحسين جودة تلطيخ، مما يتيح الاستحواذ التلقائي من المقاطع العرضية كلها وتقدير التلقائي للسكان الألياف مع يماغيج. لهذا الغرض، يتم قطع العضلات والهيكل العظمي جزءا لا يتجزأ في المقاطع العرضية، ملطخة باستخدام الميوسين السلاسل الثقيلة الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة فلوري الثانوية ودابي لتلطيخ الخلايا نوى. ثم يتم فحص المقاطع العرضية كلها تلقائيا باستخدام ماسح ضوئي الشرائح للحصول على دقة عالية مركبصور من العينة بأكملها. يتم تنفيذ التحليلات السكان الألياف في وقت لاحق لتحديد الألياف البطيئة والمتوسطة والسريعة باستخدام ماكرو الآلي ليماغيج. لقد أثبتنا سابقا أن هذه الطريقة يمكن تحديد السكان الألياف موثوق بها إلى درجة من ± 4٪. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يقلل من التباين بين المستخدم والوقت في التحليلات باستخدام بشكل كبير من منصة يماغيج مفتوحة المصدر.
Introduction
الهيكل العظمي تكوين العضلات يخضع لتغيرات عميقة خلال العمليات الفسيولوجية مثل الشيخوخة 1، 2، 3 التمرين، 4، 5، 6، 7، أو العمليات الفيزيولوجية المرضية مثل مرض 8، 9، 10 أو صدمة 11. وبالتالي، عدة مجالات تركيز الأبحاث على تأثيرات هيكلية هذه العمليات لفهم التغيرات الوظيفية. أحد الجوانب الرئيسية التي تحدد وظيفة العضلات هو تكوين ألياف العضلات. ألياف العضلات تعبر عن الميوسين مختلفة السلسلة الثقيلة (MHC) البروتينات وبالتالي تصنيفها إلى بطء والمتوسطة، أو سريعة الألياف 7، 12، 13 </sup > و 14 و 15 و 16 و 17. من الناحية الفسيولوجية والعضلات ومختلفة التراكيب الألياف العضلية اعتمادا على وظيفتها في الجسم. استخدام العضلات الألياف الكتابة، يمكن قياسها كميا السكان الألياف لتحديد التأقلم مع العمليات الفيزيولوجية المرضية في جسم المريض أو 7، 17. تاريخيا، تم تطبيق عدد من الأساليب تستغرق وقتا طويلا للتمييز بين أنواع الألياف العضلية. لهذا الغرض، تم تصنيف ألياف العضلات إما عن طريق التفاعل من أتباز الميوسين في مستويات الحموضة المختلفة أو نشاط انزيم العضلات. كما لا يمكن تقييم الصفات الألياف المختلفة في مقطع واحد، وطلب من المقاطع العرضية المتعددة لتحديد جميع الألياف العضلية والسماح دليل الكمي 14، 16، 17،= "XREF"> 18 و 19 و 20 و 21 و 22. في المقابل، استخدمت المنشورات الحديثة المناعية (IHC) ضد الميوسين بروتين سلسلة ثقيلة وصمة عار بسرعة أنواع الألياف متعددة في المقاطع العرضية واحدة. واستنادا إلى مزايا هذا الإجراء، ويعتبر الآن معيار الذهب في تحليل الألياف العضلية السكان 19 و 23 و 24. عن طريق تحسين بروتوكولات تلطيخ IHC، تمكنا مؤخرا لإظهار أن الاستيلاء التلقائي بالكامل من كامل أقسام العضلات الصليب ولاحق التلقائي الكمي الألياف العضلية ممكنا باستخدام منصة يماغيج مفتوحة المصدر. مقارنة الكمي اليدوي، شريطة إجراء لدينا انخفاض ملحوظ في الوقت المناسب (ما يقرب من 10٪ من دليل تحليل) المطلوبة لكل شريحة في حين يجري بدقة ± 4٪ 25 </sتصل>.
ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو لوصف دليل سريع وموثوق بها، مستقلة المستخدم على التلقائية الكمي الألياف العضلية في عضلات الفئران بأكملها باستخدام منصة مفتوحة المصدر. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف التعديلات المحتملة التي من شأنها أن تسمح استخدامه لعينات أخرى مثل الفئران أو عضلات الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، علينا أن نظهر منهجية يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة وتحديد السكان الألياف العضلية من أقسام الفئران عبر عبر المناعية بطريقة فعالة الوقت تلقائيا. للاستنساخ، نقدم خطوة مفصلة وصف خطوة والتعديلات المحتملة للتطبيقات في الأنواع الأخرى غير الوارد وصفها في …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل مؤسسة أبحاث كريستيان دوبلر. ونود أن نشكر سابين راوشر من مرفق التصوير الأساسية في كلية الطب بجامعة فيينا، النمسا لدعم جميع مراحل المشروع. وقد وضعت الأجسام المضادة الأولية التي كتبها شيافينو مسيرته، S.، تم الحصول عليها من دراسات البنك التنموي ورم هجين، التي تم إنشاؤها من قبل معاهد الصحة القومية من المعاهد الوطنية للصحة وحافظت في جامعة ولاية ايوا، قسم الأحياء، مدينة أيوا، IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
Riferimenti
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
