En hurtig Automatiseret Protokol for muskelfiber Population Analysis i rottemuskel tværsnit Brug af myosin Heavy Chain Immunhistokemi
Summary
Her præsenteres en protokol for hurtig muskelfiber analyser, som giver forbedret farvning kvalitet, og dermed automatisk erhvervelse og kvantificering af fiber befolkninger ved hjælp af frit tilgængelig software ImageJ.
Abstract
Kvantificering af muskelfiber populationer giver en dybere indsigt i virkningerne af sygdom, traumer og forskellige andre påvirkninger på skeletmuskulatur sammensætning. Forskellige tidskrævende metoder er traditionelt blevet anvendt til at undersøge populationer fiber i mange forskningsområder. Men for nylig udviklet immunhistokemiske metoder baseret på myosin tung kæde-proteinekspression giver et hurtigt alternativ til at identificere flere fibertyper i en enkelt sektion. Her præsenteres en hurtig, pålidelig og reproducerbar protokol for forbedret farvning kvalitet, hvilket tillader automatisk overførsel af hele tværsnit og automatisk kvantificering af fiber populationer med ImageJ. Til dette formål er indlejret skeletmuskulatur skåret i tværsnit, farvet under anvendelse af myosin tunge kæder antistoffer med sekundære fluorescerende antistoffer og DAPI for cellekerner farvning. Hele tværsnit scannes derefter automatisk ved hjælp af en glider scanner til at opnå høj opløsning kompositbilleder af hele prøven. Fiber population analyser efterfølgende udført for at kvantificere langsomme, mellemliggende og hurtige fibre ved anvendelse af en automatiseret makro til ImageJ. Vi har tidligere vist, at denne metode kan identificere populationer fiber pålideligt til en grad på ± 4%. Desuden er denne fremgangsmåde reducerer inter-bruger variabilitet og tid pr analyser markant ved open source platform ImageJ.
Introduction
Skeletmuskel undergår dybtgående ændringer i løbet fysiologiske processer såsom aldring 1, 2, motion 3, 4, 5, 6, 7 eller patofysiologiske processer såsom sygdom 8, 9, 10 eller traume 11. Derfor, for at flere forskningsområder koncentrat på de strukturelle virkninger af disse processer forstå funktionelle ændringer. Et af de vigtigste aspekter ved bestemmelse muskelfunktion er sammensætningen af muskelfibre. Muskelfibre udtrykker forskellige myosin tung kæde (MHC) proteiner og derved klassificeres i langsomme, mellemliggende eller hurtige fibre 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Fysiologisk, muskler har forskellige muskel fibersammensætninger afhængig af deres funktion i kroppen. Anvendelse muskelfibrene skrive, kan fiber populationer kvantificeres at identificere tilpasning til fysiologiske eller patofysiologiske processer 7, 17. Historisk set har et antal tidskrævende metoder blevet anvendt til at skelne mellem muskel fibertyper. Til dette formål blev muskelfibre klassificeret enten ved reaktivitet af myosin ATPase ved forskellige pH-niveauer eller muskel enzymaktivitet. Da forskellige fibre kvaliteter ikke vurderes i en enkelt sektion, blev flere tværsnit kræves for at identificere alle muskelfibre og tillader manuel kvantificering 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. I modsætning hertil nylige publikationer anvendt immunhistokemi (IHC) mod myosin tung kæde protein til hurtigt at farve flere fibertyper i en enkelt tværsnit. Baseret på fordelene ved denne procedure, er det nu betragtes som den gyldne standard i muskelfibrene populationsanalyse 19, 23, 24. Anvendelse forbedrede IHC farvningsprotokoller, var vi for nylig kunne vise, at den fuldautomatiske erhvervelse af hele muskel tværsnit og efterfølgende automatisk muskelfibrene kvantificering er muligt ved at anvende open source-platform ImageJ. Forhold til manuel kvantificering, vores procedure en signifikant kortere (ca. 10% af manuel analyser) kræves per slide samtidig være nøjagtighed på ± 4% 25 </sop>.
Det overordnede mål med denne fremgangsmåde er at beskrive en hurtig, pålidelig, brugervenlig uafhængig guide til automatisk muskelfibrene kvantificering i hele rotte muskler under anvendelse af en open source platform. Desuden beskriver vi potentielle modifikationer, som ville tillade dets anvendelse til andre prøver, såsom mus eller humane muskler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her udviser vi en bredt tilgængelig metode til at studere og automatisk kvantificere muskelfibrene populationer af rotte tværsnit via immunhistokemi på en tidseffektiv måde. For reproducerbarhed præsenteres en detaljeret trinvis beskrivelse og potentielle ændringer til anvendelser i andre arter, der ikke er beskrevet i denne undersøgelse. Desuden diskuterer vi fordelene ved den procedure, forudsætninger for optimal funktion og dens begrænsninger.
Øjeblikket, en række farvnin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Christian Doppler Grundforskningsfond. Vi vil gerne takke Sabine Rauscher fra Core Facility Imaging på det medicinske universitet i Wien, Østrig til støtte gennem hele projektet. Primære antistoffer blev udviklet af Schiaffino, S., opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank, skabt af NICHD af NIH og vedligeholdes på The University of Iowa, Biologisk Institut, Iowa City, IA.
Materials
| O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
| Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
| Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
| phosphate buffered saline | |||
| Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
| Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
| DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
| Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
| TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
| Primary antibodies | |||
| MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
| Secondary antibodies | |||
| Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |
Riferimenti
- Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
- Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
- Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
- Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
- Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
- Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
- Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
- Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
- Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
- Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
- Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
- Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
- Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
- Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
- Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
- Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
- Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
- Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
- Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
- Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
- Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
- Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).
