Nous présentons ici un protocole d'analyse des fibres musculaires rapides, ce qui permet une meilleure qualité de coloration, et ainsi l'acquisition automatique et la quantification des populations de fibres à l'aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement.
Quantification des populations de fibres de muscle donne une idée plus précise des effets de la maladie, un traumatisme, et d'autres influences sur la composition du muscle squelettique. Diverses méthodes chronophages ont traditionnellement été utilisées pour étudier les populations de fibres dans de nombreux domaines de recherche. Cependant, récemment mis au point des méthodes immunohistochimiques basées sur l'expression des protéines de chaîne lourde de la myosine fournir une alternative rapide pour identifier les types de fibres multiples dans une seule section. Nous présentons ici un protocole rapide, fiable et reproductible pour une meilleure qualité de coloration, ce qui permet l'acquisition automatique des sections entières et la quantification automatique des populations de fibres avec ImageJ. A cet effet, les muscles squelettiques sont coupés intégrés dans les sections transversales, colorées à l'aide des anticorps chaînes lourdes de myosine avec des anticorps fluorescents secondaires et DAPI pour la coloration des noyaux de cellules. des sections transversales entières sont ensuite balayées automatiquement à l'aide d'un scanner de diapositives pour obtenir composite à haute résolutionimages de l'échantillon entier. Les analyses de la population des fibres sont ensuite effectuées pour quantifier les fibres lentes, intermédiaires et rapides en utilisant une macro automatique pour ImageJ. Nous avons déjà montré que cette méthode permet d'identifier les populations de fibres de manière fiable à un degré de ± 4%. De plus, cette méthode réduit la variabilité inter-utilisateur et le temps par des analyses en utilisant de manière significative la plate-forme open source ImageJ.
Composition du muscle squelettique subit de profondes modifications au cours des processus physiologiques tels que le vieillissement 1, 2, 3 exercice, 4, 5, 6, 7 ou processus pathophysiologiques telles que la maladie 8, 9, 10 ou 11 traumatisme. Par conséquent, plusieurs champs de concentré de recherche sur les effets structurels de ces processus pour comprendre les changements fonctionnels. L'un des aspects clés qui déterminent la fonction musculaire est la composition des fibres musculaires. Les fibres musculaires expriment différentes chaînes lourdes de myosine (MHC) des protéines et sont ainsi classés en fibres lentes, intermédiaires, ou rapides 7, 12, 13 </sup >, 14, 15, 16, 17. Physiologiquement, les muscles ont différentes compositions de fibres de muscle selon leur fonction dans le corps. En utilisant typage des fibres musculaires, les populations de fibres peuvent être quantifiés pour identifier l' adaptation à des processus physiologiques ou physiopathologiques 7, 17. Historiquement, un certain nombre de méthodes qui prennent du temps ont été appliquées à la différence entre les types de fibres musculaires. A cet effet, les fibres musculaires ont été classés soit par la réactivité de la myosine ATPase à différents niveaux de pH ou de l'activité enzymatique musculaire. Comme différentes qualités de fibres ne peuvent pas être évalués en une seule section, les sections transversales multiples ont été nécessaires pour identifier toutes les fibres musculaires et de permettre la quantification manuelle 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. En revanche, les publications récentes utilisées immunohistochimie (IHC) contre la protéine de chaîne lourde de myosine pour colorer rapidement plusieurs types de fibres dans une seule des sections transversales. Sur la base des avantages de cette procédure, il est maintenant considéré comme l'étalon-or dans l' analyse de la population des fibres musculaires 19, 23, 24. En utilisant l'amélioration des protocoles de coloration IHC, nous avons récemment pu montrer que l'acquisition automatique des sections entières de croix musculaire et la quantification ultérieure des fibres musculaires automatique est possible en utilisant la plate-forme open source ImageJ. Par rapport à la quantification manuelle, notre procédure a fourni une diminution significative du temps (environ 10% des analyses manuelle) requise par diapositive tout en étant précis à ± 4% 25 </sup>.
L'objectif global de cette méthode est de décrire un guide rapide, fiable, indépendante de l'utilisateur à la quantification des fibres musculaires automatique dans les muscles entiers de rat en utilisant une plate-forme open source. De plus, nous décrivons les modifications potentielles qui permettraient son utilisation pour d'autres spécimens tels que des souris ou des muscles humains.
Ici, nous démontrons une méthodologie largement accessible pour étudier et quantifier automatiquement les populations de fibres musculaires des sections de rat par immunohistochimie dans un temps de manière efficace. Pour la reproductibilité, nous présentons une étape détaillée par la description de l'étape et les modifications potentielles pour des applications dans d'autres espèces ne sont pas décrites dans cette étude. De plus, nous discutons des avantages de la procédure, les conditions p…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été soutenue par la Fondation pour la recherche Christian Doppler. Nous tenons à remercier Sabine Rauscher de l'imagerie de l'installation de base à l'Université médicale de Vienne, en Autriche pour le soutien tout au long du projet. Les anticorps primaires ont été développés par Schiaffino, S., obtenu à partir de l'études du développement Hybridome Bank, créée par le NICHD du NIH et maintenu à l'Université de l'Iowa, Département de biologie, Iowa City, IA.
O.C.T compound | Tissue-Tek, Sakura, Netherlands | For embedding of muscle tissue | |
Isopentane | for adequate freezing of muscle tissue | ||
Superfrost Ultra Plus slides | Thermo Scientific, Germany | 1014356190 | adhesive slides |
phosphate buffered saline | |||
Triton X-100 | Thermo Scientific, Germany | 85112 | Detergent Soluation |
Goat serum | Thermo Scientific, Germany | 50197Z | Goat Serum |
DAKO Fluorescent Mounting Medium | Dako Denmark | S3023 | |
Dako pen | Dako Denmark | S200230-2 | |
TissueFAXSi plus | TissueGnostics, Vienna, Austria | ||
Primary antibodies | |||
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) | Supernatant | |
Secondary antibodies | |||
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b | Thermo Scientific, Germany | A-21146 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) | Thermo Scientific, Germany | A-21121 | |
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain), | Thermo Scientific, Germany | A-21426 | |
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent | Thermo Scientific, Germany | R37606 |