sebrafisk<em> In Situ</em> Spinal Cord Forberedelse til Elektrofysiologiske Opptak fra Spinal sensoriske og motoriske nevroner

Summary

Dette manuskriptet beskriver fremgangsmåter for elektrofysiologiske opptak fra spinalnerveceller sebrafisk embryoer og larver. Preparatet holder neuroner in situ og ofte innebærer minimal disseksjon. Disse fremgangsmåter tillater for den elektrofysiologisk undersøkelse av en rekke av spinalnerveceller, fra den første elektriske eksitabilitet anskaffelse gjennom de tidlige larvestadier.

Abstract

Sebrafisk, først introdusert som en utviklingsmodell, har vunnet popularitet på mange andre områder. Den enkle oppdrett av et stort antall av rask utvikling av organismer, kombinert med den embryoniske optisk klarhet, tjente som initielle overbevisende egenskaper i denne modellen. I løpet av de siste to tiårene, har suksessen med denne modellen blitt ytterligere drevet av sin amenability til store mutagenese skjermer og av den enkle transgenesis. Mer nylig har gen-redigering tilnærminger utvidet makt modellen.

For nevrologiske undersøkelser, sebrafisk embryo og larve tilveiebringe en modell for hvilken flere fremgangsmåter kan anvendes. Her fokuserer vi på metoder som gjør studiet av en essensiell egenskap av nerveceller, elektrisk oppstemthet. Vår forberedelse for den elektrofysiologisk undersøkelse av sebrafisk spinalnerveceller innebærer bruk av veterinær sutur lim til feste av preparatet til et registreringskammer. Alternative metoder for opptakfra sebrafisk embryoer og larver involverer festing av preparatet til kammeret ved hjelp av en fin wolfram pinne ^{1, 2, 3, 4, 5.} En wolfram tapp blir oftest brukt til å montere preparatet i en lateral retning, selv om det har vært brukt for å montere larver ryggsiden opp ^fire. Suturen limet er blitt brukt til å montere embryoer og larver i begge orienteringer. Ved hjelp av lim, kan en minimal disseksjon skal utføres, noe som gir tilgang til spinale nerveceller uten bruk av en enzymatisk behandling, for derved å unngå eventuelle skader. Men for larver, er det nødvendig å bruke en kort enzym behandling for å fjerne muskelvevet som omgir ryggmargen. Metodene som beskrives her er blitt brukt til å studere de iboende elektriske egenskapene til motoriske nevroner, interneuroner og sensoriske neuroner hos flere developmentâl trinn ^{6, 7, 8, 9.}

Introduction

George Streisinger banebrytende bruk av Danio rerio, vanligvis kjent som sebrafisk, som et modellsystem for den genetiske analyse av virveldyr utvikling ^10. Modellen gir flere fordeler, inkludert: (1) forholdsvis enkel og rimelig husdyrhold; (2) ytre befruktning, noe som gir enkel tilgang til embryoer fra de tidligste utviklingsstadier; og (3) en gjennomsiktig embryo, noe som tillater direkte og gjentatt observasjoner av celler, vev og organer som de danner.

I løpet av de neste tiårene, flere fremskritt ytterligere økt effekt av sebrafisk modell. Spesielt termin genetiske skjermer og hel-genomsekvense anstrengelser vært sentrale i identifikasjon av mutasjoner og gener som er kritiske for mange utviklingsmessige prosesser ^{11, 12, 13, 14,}"> ^15, har ^16. Gateway kloningsfremgangsmåter tillot rutinemessig anvendelse av transgene nærmer seg ^{17, 18.} Nylige fremskritt innen genomet redigering, eksemplifisert ved transkripsjonsaktivator-lignende (Talens) og gruppert regelmessig avstandsplasserte korte palindromiske gjentagelser (CRISPR) -Cas9 nukleaser, muliggjøre målrettet innføring av mutasjoner, samt knock-out og knock-in nærmer seg ^{19, 20, 21, 22.} Kombinert disse metoder gjør sebrafisk et kraftig modell for studiet av de genetiske mekanismer som ligger under spesiell oppførsel og en rekke menneskelige sykdommer ^{23, 24, 25, 26, 27.}

Dette arbeidet fokuserer på å utviklemental regulering og rollen til elektriske aktiviteten i neuronal utvikling. Fokuset er på ryggmargen, som sebrafisk-modellen gir flere fordeler. For det første er det relativt enkelt å få tilgang til sebrafisk på embryonale og larvestadier; Derfor kan man studere ryggmarg funksjon under utviklingsstadier som har færre nevroner og enklere kretser ^{28, 29.} Dessuten har den sebrafisk ryggmarg et variert sett av neuroner, i likhet med andre virveldyr, som vist ved karakteristiske og karakteristiske mønster av transkripsjonsfaktorene ^{30, 31, 32, 33, 34, 35.}

De fleste studier i zebrafisk som tar sikte på å avdekke de mekanismer som ligger til grunn for funksjonen til ryggmargkretser, særligde som støtter bevegelse, er forståelig fokusert på larvestadier ^{36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.} Imidlertid er mange av de nervecellene som danner rygg lokomotiv nettverkene initiere deres differensiering på tidlige stadier embryonale, ~ 9-10 timer etter befruktning (HPF) ^{44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51.} I lys av dette, forstå hvordan de morfologiske og elektriske egenskapene til spinal nevroner oppstår og endring mellom embryonale og larvestadier er viktig for en Overall forståelse av muskel krets dannelse og funksjon.

Disseksjon metoder som er beskrevet her tillater patch clamp opptak fra spinale nerveceller, og har blitt brukt ved embryonale stadier (~ 17-48 HPF) og larvestadier (~ 3-7 dager efter befruktning [dpf]). Denne tilnærmingen begrenser mengden av disseksjon er nødvendig for å gi tilgang til nervecellene av interesse. Protokollen er forskjellig fra de fleste av de andre publiserte metoder for innspilling fra sebrafisk spinale nerveceller i den veterinær sutur lim anvendes, snarere enn en fin wolfram tapp, for å feste embryoet eller larve til opptakskammeret. Tilgjengeligheten av to forskjellige fremgangsmåter (dvs. sutur lim versus wolfram pin) for montering av sebrafisk embryoer eller larver for elektrofysiologisk analyse gir forskere med alternative muligheter for å oppnå deres spesifikke eksperimentelle mål.

Først prosedyrer for tilgang til og opptak fra en pop stimulering av primære sensoriske nevroner, Rohon-Beard-celler, er beskrevet. Cellelegemer av disse nevronene ligge innenfor den dorsale ryggmargen. Rohon-Beard celler eksistere i tallrike virveldyrarter, differensiere tidlig i utviklingen, og til grunn for den embryonale trykkpunkt ^{6, 44, 47, 48.}

For det andre rutiner for tilgang og opptak fra spinal motor nevroner er detaljert. Sebrafisk spinal motoriske nerveceller oppstår i løpet av to bølger av neurogenesis. De tidligere-født primære motoriske nevroner oppstår ved slutten av gastrulation (~ 9-16 HPF), med bare 3-4 primære motoriske neuroner tilstede pr hemisegment ^{45, 46, 49.} I motsetning til dette, er det senere-fødte populasjon av sekundære motoriske nevroner mer tallrike, og det oppstår i løpet av en forlenget periode, som starter på ~ 14 HPFef "> ^{45, 50.} Sekundær motoriske nevroner genese i midten av transportsegmenter er hovedsakelig fullført etter 51 HPF ^50. Sekundære motoriske neuroner er ansett for å være av den motsvarende motoriske nevroner i amniotes ^46. Interessant nok supraspinal neuroner, via dopamin, regulere bevegelses i larven og sekundære motoriske nevroner genese i embryo og unge larver ^{50, 51.} primære og sekundære motoriske nevroner hver omfatter flere forskjellige subtyper. hver primære motoriske nevron subtype prosjekter en perifer nervefiber som innerverer en karakteristisk muskelgruppe, noe som resulterer i en stereotype, identifisering av aksonal bane. Vanligvis sekundære motoriske nevroner følge aksonale veier som tidligere er etablert av primær motoriske neuroner. Således, med hensyn til aksonal baner, primære og sekundære motoriske nevroner er like, med unntak av at axonal tykkelse og størrelse somata enre større for primære motoriske nevroner ^45.

For det tredje, er fremgangsmåter for innspilling fra noen få typer av interneuroner diskutert. I disse tilfeller er en begrenset mengde av fjerning av andre ryggmarg celler som kreves, og dermed ryggmargen er mindre enn intakt for opptak fra Rohon-Beard celler eller motoriske neuroner.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, Office of Laboratory Animal Resources, University of Colorado Anschutz medisinske høyskole). 1. Sebrafisk Husbandry Øke og bibeholde voksne sebrafisk (Danio rerio) ved 28,5 ° C på en 10 timers mørk / 14 h lett syklus og med passende vannbehandling og utveksling 52. Hev sebrafisk embryoer / larver ved 28,5 ° C i embryo medium inntil de når det ø…

Representative Results

Vi har nå registrert fra Rohon-Beard nevroner i 17 HPF embryoer gjennom syv dpf larver (figur 5A og 5B). Når Rohon-Beard celler ble registrert, ble preparatet montert ryggsiden opp. En slik montering gjør det mulig å entydig identifisering av Rohon-Beard celler basert på deres overfladiske dorsal stilling og store soma størrelser. Identifiseringen er i tillegg bekreftet av den stereotype hyperpolariserte hvile-membranpotensialet av disse neuronene …

Discussion

Metodene som beskrives her muliggjør den elektriske og morfologiske karakterisering av sensoriske og motoriske nerveceller av sebrafisk embryoer etter minimal disseksjon av ryggmargen. Neuroner holde seg friske i minst 1 h, som er grensen pålegges disse opptakene. Neuroner blitt tatt opp ved bruk av standard helcellekonfigurasjonen, samt fra kjerneholdige flekker; den sistnevnte metode reduserer avstanden-clamp-problemer som kan utelukke en detaljert biofysisk studie av ionestrømmer ^9.

<p …

Materials

Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore	Corning	431096
Syringe filter 0.2 mm	Whatman	6780-2502
Tricaine	Sigma	A-5040	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
a-bugarotoxin	Tocris	11032-79-4
Tetrodotoxin	Tocris	4368-28-9
Alexa-549 hydrazine salt	Molecular Probes	A-10438	fluorescent dye
Spin-X centrifuge tube filter	Corning	8161
Glass microscope slide	Fisher	12-550C
Sylgard silicone elastomer kit	Dow Corning	184	silicone elastomer
Petri dishes	Falcon	351029
Borosilicate glass capillaries	Harvard Apparatus	30-0038	inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)
Borosilicate glass capillaries	Drummond Scientific	1-000-1000-100	inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)
Miniature barbed polypropylene fitting	Cole-Palmer	6365-90
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Collagenase XI	Sigma	C7657
Microelectrode puller	Sutter Instruments	Model P-97
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Head stage	Molecular Devices	CV203BU
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Tygon tubing	Fisher	14-169-1B	ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)
Electrode holder	Molecular Devices	1-HC-U
Pharmaseal Three-Way Stopcocks	Baxter	K75
Digitizer	Axon Instruments	Digidata 1440A
Inverted microscope	Zeiss	Axioskop2 FS plus
40x/0.80w Achroplan objective	Zeiss
Data acquisition and analysis software	Axon Instruments	PClamp 10 – Clampex and Clampfit
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and Recording Solutions(in mM)
All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 – 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).
The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20°C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.
Dissection/Ringer’s solution			145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)
Pipette (intracellular) recording solution			135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).
Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp			125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).
Alexa-594 hydrazine salt stock solution.			Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 µl) and store at -20°C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution  with a centrifuge tube filter.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immobilizing agents
0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)			Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris
		Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20°C.
		For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media
250 μM α-bungarotoxin		Prepare a 250 μM stock in ddH2O (1 mg/500 μl), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C.
		For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.
1 mM Tetrodotoxin		Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C.
		For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.