זברה<em> באתרו</em> הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Summary

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

Abstract

הזברה, הוצג לראשונה כדגם התפתחותית, זכו לפופולריות בתחומים רבים אחרים. ההקלות של גידול במספר גדול של אורגניזמים המתפתח במהירות, בשילוב עם הבהירות האופטית העוברית, שמשו תכונות משכנעות ראשוניות של הדגם הזה. במהלך שני העשורים האחרונים, את ההצלחה של המודל הזה כבר מונע יותר על ידי המוכנות שלה למסכי mutagenesis בקנה מידה גדולה ועל ידי הקלות של transgenesis. לאחרונה, גישות לעריכת הגן הרחיבו את כוחו של המודל.

עבור מחקרים נוירו-התפתחותיות, עובר זחל דג הזברה לספק מודל שאליו מספר שיטות ניתן ליישם. כאן, אנו מתמקדים שיטות המאפשרות חקר נכס מהותי של נוירונים, רגישות חשמלית. ההכנה שלנו לחקר אלקטרו של נוירונים שדרת דג זברה כרוכה בשימוש דבק תפר וטרינר כדי לאבטח את ההכנה כדי בתא הקלטה. שיטות חלופיות עבור הקלטהמעובר ואת זחלי דג זברה לערב את הקובץ המצורף של ההכנה לתא באמצעות סיכת טונגסטן בסדר ^{1, 2, 3, 4, 5.} סיכת טונגסטן משמשת לרוב כדי להרכיב את ההכנה בכיוון לרוחב, אם כי זה כבר נעשה שימוש כדי לעלות בצד הגבי זחלים עד ^4. דבק התפר שמש הר עובר וזחלי הנטיות הן. באמצעות דבק, לנתיחה מינימלי יכול להתבצע, מה שמאפשר גישה הנוירונים השדרה ללא שימוש טיפול אנזימטי, ובכך למנוע כל נזק כתוצאה. עם זאת, עבור הזחלים, יש צורך להחיל טיפול אנזים קצר כדי להסיר את רקמת השריר המקיף את חוט השדרה. השיטות שתוארו כאן שימשו ללמוד את התכונות החשמליות הפנימי של הנוירונים המוטוריים, interneurons, ואת עצב סנסורי בכמה developmentÃl טיולי ^{6, 7, 8, 9.}

Introduction

ג'ורג Streisinger חלוץ בשימוש Danio rerio, הידוע בכינויו דג הזברה, כמערכת מודל לניתוח גנטי של התפתחות החולייתנים ^10. המודל מציע מספר יתרונות ובהם: (1) יחסית גידול בעלי חיים פשוט וזול; (2) הפריה חוץ, המאפשר גישה קלה עוברים מן שלבי ההתפתחות המוקדמים; ו (3) העובר שקוף, המאפשר תצפיות ישירות חוזרות ונשנות של תאים, רקמות, ואיברים כפי שהם יוצרים.

במשך העשורים שלאחר מכן, מספר התקדמויות נוספות הגדילו את כוחו של המודל דג הזברה. בפרט, מסכי גנטי קדימה מאמצים רצף שלם-בגנום מילאו תפקידי מפתח לזיהוי מוטציות בגנים קריטי לתהליכים התפתחותיים רבים ^{11, 12, 13, 14,}"> ^{15, 16.} שיטות שיבוט Gateway אפשרו היישום השיגרתי של מהונדס מתקרב ^{17, 18.} התקדמות העריכה בגנום, שהודגמה על ידי מפעיל דמוי שעתוק (TALENs) ומתקבצות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצרות (קריספר) -Cas9 nucleases, לאפשר את כניסתה של מוטציות הממוקדות, וכן נוק-אאוט ולהפיל-בגישות ^{19, 20, 21, 22.} משולבים, שיטות אלה להפוך דג זברה כמודל עצמה לחקר המנגנונים הגנטיים הבסיסיים התנהגויות מסוימות ומחלות אנושיות מספר ^{23, 24, 25, 26, 27.}

עבודה זו מתמקדת בפיתוחתקנה נפשית ואת התפקיד של פעילות חשמלית התפתחות עצבית. הדגש הוא על חוט השדרה, עבורו מודל דג הזברה מספק מספר יתרונות. ראשית, קל יחסית לגשת דג זברה בשלבים עובריים זחל; לפיכך, אפשר ללמוד לתפקד חוט שדרה במהלך שלבי התפתחות שיש פחות תאי עצב ומעגלים פשוטים ^{28, 29.} יתר על כן, בחוט שדרת דג הזברה יש קבוצה מגוונת של נוירונים, בדומה חוליות אחרות, כפי שהוכח על ידי תבניות אופייניות ו היכר של שעתוק גורמי ^{30, 31, 32, 33, 34, 35.}

רוב המחקרים דג הזברה שמטרתם לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס פונקציה של מעגלים בחוט השדרה, במיוחדאלה שתומכים תנועה, ממוקדים באופן מובן על שלבי הזחל ^{36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43.} עם זאת, רבים של נוירונים היוצרים את רשתות קטר השדרה ליזום בידול שלהם בשלבים עובריים מוקדמים, ~ 9-10 שעות לאחר ההפריה (hpf) ^{44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51.} לאור זאת, ההבנה כיצד המאפיינים המורפולוגיים וחשמליים של נוירונים שדרה להתעורר ולהשתנות בין השלבים העובריים זחל חשוב עבור overaהבנת ll של היווצרות מעגל תנועה ותפקוד.

שיטות לנתיחה המתוארת כאן לאפשר הצמד תיקון הקלטות מתא עצב השדרה יושמו בהצלחה בשלבים עובריים (~ 17-48 hpf) ואת שלבי הזחל (~ הפריה 3-7 ימים שלאחר [DPF]). גישה זו מגבילה את כמות דיסקציה נדרש לספק גישה נוירונים של עניין. הפרוטוקול שונה ממרבית השיטות שפורסמו אחרים להקלטה מתא עצב שדרת דג זברה כי דבק תפר הווטרינר משמש, ולא סיכת טונגסטן בסדר, לצרף את העובר או זחל לתא ההקלטה. הזמינות של שתי גישות שונות (כלומר, דבק תפר מול סיכת טונגסטן) להרכבת עוברי דג הזברה או זחלים לניתוח אלקטרו מספקת לחוקרים עם אפשרויות חלופיות כדי להשיג מטרות הניסוי הספציפיות שלהם.

ראשית, נהלים לגישה והקלטה של ​​פופ ulation של עצב סנסורי עיקרי, תאי Rohon-בירד, מתוארים. גופי התא של הנוירונים האלה נמצאים בתוך חוט השדרה הגבי. תאי Rohon-בירד קיימים מינים בעלי חוליות רבים, להבדיל מוקדם בהתפתחות, והם עומדים ביסוד בתגובה למגע העוברי ^{6, 44, 47, 48.}

שנית, נהלים לגישה והקלטה מן הנוירונים המוטוריים השדרה מפורטים. הנוירונים מוטורי שדרת זברה להתעורר במהלך שני גלים של נוירוגנסיס. הנוירונים המוטוריים העיקריים מוקדם היליד להתעורר בסוף gastrulation (~ 9-16 hpf), עם רק 3-4 הנוירונים מוטוריים העיקרי כיום לכל hemisegment ^{45, 46, 49.} לעומת זאת, האוכלוסייה מאוחר היליד של הנוירונים מוטוריים משניים היא יותר רבה מתעוררת במהלך תקופה ממושכת, החל מהשעה ~ 14 hpfEF "> ^{45, 50.} בראשית משניים הנוירון המוטורי בפלחי-הגזע באמצע תושלם ברובה על ידי 51 hpf ^50. הנוירונים המוטוריים משניים נחשבים המקבילה של הנוירונים המוטוריים ב אמניוטים ^46. מעניין, נוירונים supraspinal, באמצעות דופמין, לווסת תנועה הזחל וג'נסיס הנוירון המוטורי משנית בעובר ו זחל צעיר ^{50, 51.} הנוירונים המוטוריים יסודי ותיכון אחד המרכיבים תת שונים. כל הפרויקטים תת הנוירון המוטורי העיקרי האקסון היקפי כי innervates קבוצת שרירים אופיינית, וכתוצאה מכך סטריאוטיפי, זיהוי מסלול אקסונלית. באופן כללי, הנוירונים מוטוריים משני לעקוב אחר מסלולי אקסונלית הוקמו בעבר על ידי נוירונים מנוע עיקריים. לפיכך, בהתייחס מסלולי אקסונלית, הנוירונים מוטוריים יסודיים ותיכון דומים, למעט כי עובי אקסונים ו somata בגודלמחדש יותר עבור הנוירונים מוטוריים עיקריים ^45.

שלישית, שיטות הקלטה מכמה סוגים של interneurons נדונות. עם זאת, במקרים אלה, כמות מוגבלת של הסרת תאים בחוט השדרה אחרים נדרשת, ובכך חוט השדרה הוא פחות שלם יותר להקלטות מתאי Rohon-בירד או הנוירונים המוטוריים.

Protocol

הנהלים כל חיה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC; משרד משאבי בחיות מעבדה, אוניברסיטת קולורדו אנשוץ קמפוס רפואי). 1. בעלי הזברה להעלות ולשמור דג הזברה מבוגר (Danio re…

Representative Results

הקלטנו בהצלחה מתא עצב Rohon-בירד ב 17 hpf עובר דרך 7 DPF זחלים (איור 5 א ו 5 ב). כאשר תאי Rohon-בירד נרשמו, ההכנה הייתה רכובה עד הגבה-לוואי. הרכבה כזו מאפשרת זיהוי חד משמעי של תאים Rohon-בירד מבוסס על עמדות הגב שטחית שלהם וגדלים סומה גדול. זיהוי הוא א…

Discussion

השיטות שתוארו כאן לאפשר אפיון חשמל מורפולוגי של נוירונים החושי והמוטורי של עוברי דג הזברה לאחר דיסקציה מינימלי של חוט השדרה. נוירונים להישאר בריאים במשך לפחות 1 h, מגבלת הזמן שהוטלה על ההקלטות הללו. נוירונים תועדו באמצעות התצורה כל התא הסטנדרטי, כמו גם מן הטלאים גרעינ…

Materials

Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore	Corning	431096
Syringe filter 0.2 mm	Whatman	6780-2502
Tricaine	Sigma	A-5040	Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
a-bugarotoxin	Tocris	11032-79-4
Tetrodotoxin	Tocris	4368-28-9
Alexa-549 hydrazine salt	Molecular Probes	A-10438	fluorescent dye
Spin-X centrifuge tube filter	Corning	8161
Glass microscope slide	Fisher	12-550C
Sylgard silicone elastomer kit	Dow Corning	184	silicone elastomer
Petri dishes	Falcon	351029
Borosilicate glass capillaries	Harvard Apparatus	30-0038	inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)
Borosilicate glass capillaries	Drummond Scientific	1-000-1000-100	inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)
Miniature barbed polypropylene fitting	Cole-Palmer	6365-90
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Collagenase XI	Sigma	C7657
Microelectrode puller	Sutter Instruments	Model P-97
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200B
Head stage	Molecular Devices	CV203BU
Motorized micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Tygon tubing	Fisher	14-169-1B	ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)
Electrode holder	Molecular Devices	1-HC-U
Pharmaseal Three-Way Stopcocks	Baxter	K75
Digitizer	Axon Instruments	Digidata 1440A
Inverted microscope	Zeiss	Axioskop2 FS plus
40x/0.80w Achroplan objective	Zeiss
Data acquisition and analysis software	Axon Instruments	PClamp 10 – Clampex and Clampfit
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-97
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and Recording Solutions(in mM)
All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 – 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).
The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20°C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use.
Dissection/Ringer’s solution			145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)
Pipette (intracellular) recording solution			135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).
Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp			125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).
Alexa-594 hydrazine salt stock solution.			Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 µl) and store at -20°C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution  with a centrifuge tube filter.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immobilizing agents
0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)			Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris
		Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20°C.
		For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media
250 μM α-bungarotoxin		Prepare a 250 μM stock in ddH2O (1 mg/500 μl), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C.
		For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.
1 mM Tetrodotoxin		Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C.
		For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.