Méthodes in vitro pour la comparaison de liaison cible et CDC induction entre les anticorps thérapeutiques: Applications dans l' analyse biosimilarité

Summary

Ce protocole décrit la comparaison in vitro de deux caractéristiques fonctionnelles principales du rituximab: liant cible et l'induction de cytotoxicité dépendante du complément (CDC). Les méthodes ont été utilisées pour une comparaison côte-à-côte entre le rituximab de référence et un rituximab biosimilaire. Ces tests peuvent être utilisés pendant le développement biosimilaire ou comme un contrôle de qualité dans leur production.

Abstract

des anticorps monoclonaux thérapeutiques (mAb) sont pertinentes pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers. Le développement d'anticorps monoclonaux biosimilaires par les entreprises pharmaceutiques est une opportunité de marché, mais il est aussi une stratégie pour accroître l'accès aux médicaments et de réduire les coûts associés à la thérapie. Les protocoles détaillés ici décrivent l'évaluation de la liaison cible et induction CDC par rituximab dans les cellules Daudi. Ces deux fonctions nécessitent différentes régions structurelles de l'anticorps et sont pertinents à l'effet clinique induite par le rituximab. Les protocoles permettent la comparaison côte à côte d'un rituximab de référence et un biosimilaire rituximab commercialisé. Les produits évalués ont montré des différences à la fois dans la liaison cible et l'induction CDC, ce qui suggère qu'il existe des différences physico-chimiques sous-jacentes et en soulignant la nécessité d'analyser l'impact de ces différences dans le cadre clinique. Les méthodes signalées constituent ici simples et peu coûteuses in vitro </ Em> modèles pour l'évaluation de l'activité des biosimilaires rituximab. Ainsi, ils peuvent être utiles au cours du développement de biosimilaires, ainsi que pour le contrôle de la qualité dans la production biosimilaire. En outre, les méthodes présentées peuvent être extrapolés à d'autres anticorps monoclonaux thérapeutiques.

Introduction

Les anticorps thérapeutiques sont des anticorps monoclonaux recombinants (mAbs) développés pour le traitement de différentes pathologies, y compris les cancers, les maladies auto-immunes et chroniques, les troubles neurologiques et autres ¹ . À l'heure actuelle, la FDA a accordé l'approbation à plus de 40 hypothèses thérapeutiques, et d'autres devraient atteindre le marché au cours des années suivantes.

Le Rituximab est un anticorps IgG1 monoclonal chimère hautement affinité approuvé pour le traitement du lymphome non Hodgkinien (LNH) CD20 ⁺ , NHL folliculaire CD20 ⁺ , leucémie lymphocytaire chronique et arthrite rhumatoïde ^{2 , 3} . La reconnaissance du CD20, qui est surexprimé dans les cellules B, par rituximab induit l'apoptose; Activation du complément; Et la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) ³ . Les brevets de ce médicament ont expiré en Europe et aux États-Unis en 2013 et 2016, respectivement. Ainsi, les entreprises pharmaceutiques du monde entier développent des biosimilaires de rituximab. Comme dans tout autre médicament destiné à la consommation humaine, les biosimilaires doivent être approuvés par les organismes de réglementation. Les directives internationales indiquent que, pour les anticorps antirétroviraux, la biosimilarité devrait être démontrée en comparant les caractéristiques physico-chimiques, la pharmacocinétique, l'efficacité et la sécurité des produits nouveaux et de référence ⁴ .

En conséquence, les méthodologies utilisées dans ces comparaisons doivent évaluer les caractéristiques structurelles et fonctionnelles des mAbs, en particulier ceux ayant une pertinence clinique. À cette fin, les essais in vitro présentent plusieurs avantages par rapport aux expériences in vivo (revues dans Chapman et al. ) ⁵ : i) les études in vitro sont plus sensibles aux différences entre le biosimilaire proposé et le produit de référence; Ii) des études in vivo doivent être effectuées dans des espèces pertinentes, qui, pour de nombreux mAbs, sontles primates non humains; et iii) étant donné que le mécanisme d'action, la toxicologie préclinique et les effets cliniques du produit de référence sont bien connues, dans des études in vivo avec biosimilaires ne peuvent pas fournir des informations utiles supplémentaires. En conséquence, l'orientation de l' Union européenne pour les biosimilaires permet aux candidats d'entrer dans des essais cliniques basés sur des données robustes in vitro seuls ^6.

Nous présentons ici deux tests rapides, économiques et simples qui évaluent l'activité biologique du rituximab en utilisant CD20 ⁺ cellules en culture. Ces tests peuvent être inclus dans le cadre de l'exercice de comparabilité pour les candidats biosimilaires rituximab.

Protocol

1. Evaluation de la liaison cible par cytométrie de flux Préparation de matériaux biologiques et de réactifs Faire 500 ml de milieu de culture RPMI supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (H-IFBS). Culture des cellules Daudi lymphome de Burkitt (Daudi) et Daudi cellules GFP + à l' aide de RPMI et 2 flacons de culture de 75 cm. Maintenir les cultures à 37 ° C dans 5% de CO 2 atmosp…

Representative Results

En utilisant les protocoles décrits ci-dessus, la cible de liaison et l'induction CDC du rituximab de référence ont été comparés en parallèle avec celles d'un biosimilaire rituximab produit et disponible dans le commerce en Asie. Dans les cellules de Daudi, les deux mAb CD20 liés d'une manière dépendante de la concentration (Figure 1D). Régressions non linéaires des données de liaison …

Discussion

L'expiration du brevet d'un mAb thérapeutique favorise le développement de biosimilaires. Ainsi, il y a un besoin de méthodes simples qui permettent d'identifier les différences dans les activités cliniques pertinentes de ces produits. Les cellules CD20 ⁺ cultivées ont été utilisées pour l'évaluation de deux caractéristiques fonctionnelles clés du rituximab: cible de liaison et l' induction CDC. L'ancienne activité nécessite la reconnaissance de CD20 par la région Fab de…

Materials

RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum(FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer.
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.