Métodos in vitro para comparar la unión de diana y la inducción de CDC entre anticuerpos terapéuticos: Aplicaciones en análisis de biosimilitud
Summary
Este protocolo describe la comparación in vitro de dos características funcionales clave del rituximab: la unión al diana y la inducción de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Los métodos se emplearon para una comparación lado a lado entre el rituximab de referencia y un biosimilar de rituximab. Estos ensayos se pueden emplear durante el desarrollo biosimilar o como un control de calidad en su producción.
Abstract
anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs) son relevantes para el tratamiento de diferentes patologías, incluyendo los cánceres. El desarrollo de anticuerpos monoclonales biosimilares por las compañías farmacéuticas es una oportunidad de mercado, pero también es una estrategia para aumentar la accesibilidad de drogas y reducir los costes asociados a la terapia. Los protocolos detallados aquí describen la evaluación de unión a la diana y la inducción CDC por rituximab en células Daudi. Estas dos funciones requieren diferentes regiones estructurales del anticuerpo y son relevantes para el efecto clínico inducida por rituximab. Los protocolos permiten la comparación de lado a lado de un rituximab referencia y un biosimilar rituximab comercializado. Los productos evaluados mostraron diferencias tanto en unión a la diana y la inducción CDC, lo que sugiere que hay diferencias fisicoquímicas subyacentes y poner de relieve la necesidad de analizar el impacto de esas diferencias en el entorno clínico. Los métodos aquí presentados constituyen simple y barato in vitro </ Em> para la evaluación de la actividad de rituximab biosimilares. Por lo tanto, pueden ser útiles durante el desarrollo biosimilar, así como para el control de calidad en la producción biosimilar. Además, los métodos presentados pueden extrapolarse a otros mAbs terapéuticos.
Introduction
Los anticuerpos terapéuticos son anticuerpos monoclonales recombinantes (mAbs) desarrollados para el tratamiento de diferentes patologías, incluyendo cánceres, enfermedades autoinmunes y crónicas, trastornos neurológicos y otros 1 . Actualmente, la FDA ha concedido la aprobación a más de 40 mAb terapéuticos, y se espera que lleguen más al mercado en los años siguientes.
Rituximab es un anticuerpo IgG1 monoclonal quimérico de alta afinidad aprobado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin de células B CD20 + , LNH folicular CD20 + , leucemia linfocítica crónica y artritis reumatoide 2 , 3 . El reconocimiento de CD20, que está sobreexpresado en células B, por rituximab induce apoptosis; activación del complemento; Y citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) 3 . Las patentes de este fármaco expiraron en Europa y en los EE.UU. en 2013 y 2016, Respectivamente. Así, las compañías farmacéuticas en todo el mundo están desarrollando biosimilares de rituximab. Como en cualquier otro medicamento para consumo humano, los biosimilares requieren la aprobación de las agencias reguladoras. Directrices internacionales indican que para los mAbs, la biosimilaridad debe demostrarse mediante la comparación de las características físico-químicas, farmacocinéticas, la eficacia y la seguridad de los productos nuevos y de referencia [ 4] .
Por consiguiente, las metodologías utilizadas en tales comparaciones deben evaluar las características estructurales y funcionales de los mAb, especialmente aquellos con relevancia clínica. Para ello, los ensayos di vitro muestran varias ventajas sobre los experimentos in vivo (revisados en Chapman et al. ) 5 : i) los estudios in vitro son más sensibles a las diferencias entre el biosimilar propuesto y el producto de referencia; Ii) deben realizarse estudios in vivo en especies relevantes, que para muchos mAbs sonPrimates no humanos; Y iii) ya que el mecanismo de acción, la toxicología preclínica y los efectos clínicos del producto de referencia son bien conocidos, los estudios in vivo con biosimilares pueden no proporcionar información útil adicional. En consecuencia, la Orientación de la Unión Europea para biosimilares permite a los candidatos a entrar en ensayos clínicos basados en sólidos datos in vitro sólo [ 6] .
Presentamos dos ensayos rápidos, económicos y sencillos que evalúan la actividad biológica de rituximab utilizando células cultivadas con CD20 + . Estos ensayos pueden incluirse como parte del ejercicio de comparabilidad para los candidatos biosimilares de rituximab.
Protocol
Representative Results
Discussion
La expiración de la patente de un mAb terapéutico está promoviendo el desarrollo de los biosimilares. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos simples que pueden identificar diferencias en las actividades de relevancia clínica de estos productos. Se emplearon células CD20 + cultivadas para la evaluación de dos características funcionales clave de rituximab: unión a la diana y la inducción CDC. La actividad anterior requiere el reconocimiento de CD20 por la región Fab del mAb, mientras que el ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | Modify the culture depending on the cell line |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | 0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Daudi Burkitt's Lymphoma Cells | ATCC | CCL-213 | You can modify the cell line depending on the antibody of interest |
| Fetal bovine serum(FBS) | GIBCO | 16000-044 | You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line |
| Normal Human Serum Complement | Quidel | A113 | It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications |
| 7AA-D | BDPharmigen | 559925 | You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability. |
| PECy5 Mouse Anti-human IgG | BDPharmigen | 551497 | Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer. |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFisher Scientific | 07-7102 | Change depending to mAb |
| BDCytofix | BDPharmigen | 554655 | Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde ) |
| PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline) | GIBCO | 70011-044 | Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free. |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 29442-068 | 12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates |
| MabThera (Rituximab) | Roche | — | Reference product |
| Rituximab | Indian | — | Biosimilar product |
| 15- or 50-mL conical centrifuge tubes | Corning | 430290 or 430052 | — |
| Pipette Tips | Eppendorf | — | Multiple volume configurations are necessary |
| Pipettes | Eppendorf | — | Adjustable-volume pipettes are necessary |
| Centrifuge 5430/ 5430R model | Eppendorf | — | Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g |
| Flow cytometer | BD Dickinson | — | BD FACSAria III or other flow cytometer |
| Olympus optical and light microscope | Olympus | — | To quantify and evaluate cell growth |
| Incubator | SANYO | — | Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells |
| Biological Safety Cabinet | CHC BIOLUS | — | Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment. |
Riferimenti
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