שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההשוואה חוץ גופייה של שני מאפיינים פונקציונליים מפתח של rituximab: היעד מחייב ולהשלים תלוי רעיל לתאים (CDC) אינדוקציה. השיטות הועסקו לקבלת השוואה מפורטת ל-צדדי בין rituximab הפניה ו biosimilar rituximab. מבחנים אלה יכולים להיות מועסקים במהלך פיתוח biosimilar או כמו בקרת איכות בייצור שלהם.

Abstract

נוגדנים חד שבטיים טיפוליים (מבז) רלוונטיים לטיפול בפתולוגיות שונה, לרבות סרטן. ההתפתחות מבז biosimilar ידי חברות תרופות היא הזדמנות בשוק, אבל זה גם אסטרטגיה להגדלת נגישות תרופה ולהפחית עלויות הקשורות בטיפול. הפרוטוקולים המפורטים כאן לתאר את ההערכה של יעד מחייב ואינדוקצית CDC ידי rituximab בתאים דאודי. שני תפקידים אלה דורשים אזורים מבניים שונים של הנוגדנים והן רלוונטיים האפקט הקליני מושרה על ידי rituximab. הפרוטוקולים מאפשרים מצד אל צד השוואה של rituximab הפניה ו biosimilar rituximab משווקים. המוצרים העריכו הראו הבדלים הוא יעד מחייב ואינדוקצית CDC, דבר המצביעים על כך שיש הבדלי physicochemical בסיסיים הדגשת הצורך לנתח את ההשפעה של הבדלים אלה במסגרת הקלינית. השיטות דיווחו כאן מהווים פשוט וזול במבחנה </ Em> מודלים להערכת הפעילות של biosimilars rituximab. לכן, הם יכולים להיות שימושיים במהלך פיתוח biosimilar, כמו גם עבור בקרת איכות בייצור biosimilar. יתר על כן, השיטות שהוצגו ניתן להסיק על מבז טיפולי אחר.

Introduction

נוגדנים טיפוליים הם נוגדנים מונוקלונליים רקומבינלים (mAB) שפותחו לטיפול בפאתולוגיות שונות, כולל סרטן, מחלות אוטואימוניות וכרוניות, הפרעות נוירולוגיות ועוד. נכון לעכשיו, ה- FDA נתן אישור ליותר מ 40 mBbs טיפולית, ועוד צפויים להגיע לשוק בשנים הבאות.

Rituximab הוא נוגדנים חד-כיווניים חד-כיווניים מסוג IgG1, שאושרו לטיפול ב- CD20 ⁺ B ללא לימפומה שאינה הודג'קין (NHL), CD20 ⁺ NHL פוליקולרי, לוקמיה לימפוציטית כרונית ודלקת מפרקים שגרונית ^{2 , 3} . ההכרה של CD20, אשר overexpressed ב B תאים, על ידי rituximab גורם אפופטוזיס; הפעלה משלימה; ואת תאי נוגדנים התאים בתיווך cytotoxicity (ADCC) ³ . פטנטים של תרופה זו פג באירופה ובארצות הברית בשנים 2013 ו 2016, בהתאמה. לפיכך, חברות תרופות ברחבי העולם מפתחים rituximab biosimilars. כמו בכל תרופה אחרת עבור הצריכה האנושית, biosimilars דורשים אישור מסוכנויות רגולטוריות. הנחיות בינלאומיות מראות כי עבור mBbs, biosimilarity צריך להיות מוכח על ידי השוואת המאפיינים הפיזיוכימיים, פרמקוקינטיקה, יעילות, ובטיחות של מוצרים חדשים התייחסות ⁵ .

לפיכך, המתודולוגיות המשמשות להשוואה זו חייבות להעריך את המאפיינים המבניים והתפקודיים של ה- MBBS, במיוחד אלו עם רלוונטיות קלינית. לשם כך, מבחני מבחנה מראים מספר יתרונות בניסויי vivo (שנבדקו ב- Chapman et al. ) ⁵ : i) במחקרים חוץ גופית רגישים יותר להבדלים בין הביוסימלר המוצע לבין מוצר הייחוס; Ii) במחקרים vivo חייב להתבצע מינים רלוונטיים, אשר עבור mAB רביםפרימטים לא אנושיים; ו iii) מאז מנגנון הפעולה, דוח הרעלים פרה-קליניים, ואת ההשפעות הקליניות של המוצר הפניה ידועים, במחקרים vivo עם biosimilars לא יכול לספק מידע שימושי נוסף. בהתאם לכך, ההנחיה של האיחוד האירופי עבור biosimilars מאפשרת מועמדים להיכנס לניסויים קליניים מבוססים על חזקה בנתונים במבחנה לבד ^6.

כאן, אנו מציגים שני מהר, כלכליים, ואת מבחנים פשוטים להעריך את הפעילות הביולוגית של rituximab באמצעות CD20 ⁺ תאים בתרבית. מבחנים אלה יכולים להיכלל במסגרת תרגיל ההשוואה למועמדי biosimilar rituximab.

Protocol

1. הערכת יעד מחייב על ידי cytometry זרימה הכנת חומרים ביולוגיים וריאגנטים הפוך 500 מ"ל של המדיום תרבות RPMI בתוספת 10% חום- inactivated עוברית בסרום עוברי (H-IFBS). <li style=";text-a…

Representative Results

באמצעות הפרוטוקולים שתוארו לעיל, למקד מחייב ואת אינדוקצית CDC של rituximab ההתייחסות הושוותה במקביל לאלו של rituximab biosimilar פיק למסחרי אסיה. בתאים דאודי, הוא מבז כבול CD20 באופן ריכוז תלוי (האיור 1D).</stro…

Discussion

הפטנט הפטנט של mAb טיפולית מקדמת את הפיתוח של biosimilars. לכן, יש צורך בשיטות פשוטות אשר יכולים לזהות הבדלים בפעילות רלוונטית קלינית של מוצרים אלה. CD20 ⁺ תאים מתורבתים הועסקו להערכת שני מאפיינים תפקודיים מרכזיים של rituximab: מחייב יעד אינדוקציה CDC. הפעילות הראשונה דורשת הכ…

Materials

RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum(FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer.
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1-4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10X (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U- bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 ° C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature andCO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.