पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति, क्रिस्टलीकरण, और बायोफिजिकल स्टडीज ऑफ़ ए<em> बेसिलस</em> -अधिकृत न्यूक्लियोटाइड पाइरोफॉस्फोरियम, बीसीएमजीजी
Summary
बैसिलस एंथ्रेसीज़ घातक इनहेलेशन संबंधी एंथ्रेक्स के बाध्यकारी रोगज़नक है, इसलिए उसके जीनों और प्रोटीनों का अध्ययन कड़ाई से नियंत्रित किया जाता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण ऑर्थोलॉगस जीनों का अध्ययन करना है हम बी। सीरियस , बीसी 1531 में बी । एन्थ्रेसीस ऑर्थोल के बायोफिजिकल अध्ययनों का वर्णन करते हैं , जिसमें न्यूनतम प्रयोगात्मक उपकरण की आवश्यकता होती है और गंभीर सुरक्षा संबंधी चिंताओं की कमी होती है।
Abstract
सच्चे रोगजनकों से जीन और प्रोटीन का अध्ययन करते समय सुरक्षा प्रतिबंधों और नियमों पर काबू पाने के लिए, उनके homologues का अध्ययन किया जा सकता है। बेसिलस एंथ्रैसिज एक बाध्यकारी रोग है जो घातक इनहेलेशन संबंधी एंथ्रेक्स का कारण होता है। बैसिलस सीरियस को बी के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल माना जाता है क्योंकि उसके करीबी विकासवादी संबंधों के कारण एन्थ्रैसिस। बी ऐन्थ्रासीस की जीन क्लस्टर बीए 1554 – बीए 1558 बी के सीरियस में बीसी 1531 – बीसी 1535 क्लस्टर से बेहद संरक्षित है, साथ ही साथ बीसीटी 1364-बीटी 1, 368 क्लस्टर के साथ बैसिलस थुरिंगिनेसिस में, बैसिलस जीनस में संबंधित जीनों की महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत देता है। यह पांडुलिपि, बी। सीरियस , बीसी 1531 में अपने ortholog के पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग करते हुए बी एन्थ्रेसीस में जीन क्लस्टर से पहले जीन ( बीए 1554 ) के एक प्रोटीन उत्पाद को तैयार करने और चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करता है।
Introduction
रीकॉंबिनेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति का व्यापक रूप से प्राकृतिक प्रोटीन स्रोतों जैसे कि सीमित प्रोटीन मात्रा और हानिकारक संदूषण के साथ जुड़ी समस्याओं पर काबू पाने के लिए उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, रोगजनक जीन और प्रोटीन के अध्ययन में, एक वैकल्पिक प्रयोगशाला तनाव जिसे अतिरिक्त सुरक्षा सावधानी की आवश्यकता नहीं होती है उसका उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, बेसिलस सीरिअस उनके करीबी विकासवादी संबंध 1 के कारण बेसिलस एंथ्रेसीस का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल है
बी। एन्थ्रैसिज एक बाध्यकारी रोगजनक है जो मनुष्यों और पशुओं में घातक इंहेलेशनल एन्थ्रैक्स का कारण बनता है और संभावित रूप से जीवनी 2 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, बी। एन्थ्रेसीस पर प्रयोगशाला अध्ययन, कंट्रोल के लिए अमेरिकी नियंत्रण केंद्रों द्वारा कड़ाई से विनियमित होते हैं, जिसमें जैव सुरक्षा स्तर 3 (बीएसएल -3) प्रथाओं की आवश्यकता होती है, जो यह जज करते हैं कि प्रयोगशाला क्षेत्र को नकारात्मक कक्ष दबाव से अलग किया जाए। बी ऐन्थ्रेसीस के विपरीत </eएम>, बी। सीरियस को बीएसएल-1 एजेंट के रूप में वर्गीकृत किया गया है और इस प्रकार कम से कम सुरक्षा संबंधी चिंताओं का है। बी। सीरियस एक अवसरवादी रोगज़नक़ है जो, संक्रमण पर, भोजन के जहर का कारण बनता है जिसे चिकित्सा सहायता के बिना इलाज किया जा सकता है। हालांकि, क्योंकि बी । सीरिजेस बी ए एन्थ्रेसीस के साथ कई महत्वपूर्ण जीन हैं, बी के कार्यों ए। एन्थ्रेसीस प्रोटीन बी के संबंधित होमोलॉजिस्ट का उपयोग करके अध्ययन किया जा सकता है।
बीए 1554 – बीए 1558 जीन क्लस्टर का बी। एन्थ्रेसीस बीसी 1531 – बीसी 1535 क्लस्टर के साथ अत्यधिक संरक्षित है जी के संगठन और अनुक्रम के संदर्भ में, बी । सीरिअस के साथ- साथ बीटी 1 364-बीटी 1 , 368 क्लैस्टर ऑफ बैसिलस थुरिंजियन्सिस के साथ । इसके अलावा, संबंधित समूहों की पहली जीन ( बीए 1554 , बीसी 1531 , और बीटी 1 364 ) पूरी तरह से संरक्षित हैं ( यानी, 100% न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम पहचान), इप्लीईबैसिलस प्रजातियों में जीन उत्पाद की एक महत्वपूर्ण भूमिका है। इन जीन क्लस्टर्स में अपने स्थान के कारण, बीए 1554 को कैथेटिव ट्रांसक्रिप्शन रेगुलेटर 3 के रूप में गलत पहचान मिली थी। हालांकि, बीए 1554 उत्पाद का अमीनो एसिड अनुक्रम विश्लेषण यह इंगित करता है कि यह माज परिवार के अंतर्गत आता है, जिसमें न्यूक्लियोटाइड पाइरोफॉस्फॉइड डीलीज़ गतिविधि है और ट्रांसक्रिप्शन कारक गतिविधि 4 , 5 के साथ जुड़ा नहीं है। यद्यपि माज़ ग्रा परिवार से सम्बंधित प्रोटीन समग्र अनुक्रम और लंबाई के संबंध में विविधतापूर्ण हैं, हालांकि वे एक सामान्य ~ 100 अवशेषों वाले मेज़ डोमेन को साझा करते हैं, जो कि एक EXXE 12-28 ईएक्सडी आकृति ("एक्स") किसी एमिनो एसिड अवशेष के लिए खड़ा है, और संख्या एक्स अवशेषों की संख्या इंगित करता है)।
MazG डोमेन हमेशा एक विशिष्ट उत्प्रेरक गतिविधि के लिए सीधे खाते नहीं करता है। Escherichia कोली (EcMazG) के एक MazG सदस्य दो MazG डोमेन के पास है, लेकिन परली सी-टर्मिनल MazG डोमेन एंजाइमेटिक रूप से सक्रिय है 6 इसके अलावा, माज एंजाइम्स की सब्सट्रेट की विशिष्टता गैर-विशिष्ट न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट्स (एक्कामाज़जी) के लिए विशिष्ट डीसीटीपी / डीएटीपी (इंटीग्रिन से जुड़ी मजदगी के लिए) और डीयूटीपी (डीयूटीपीस के लिए) 6 , 7 , 8 , 9 से भिन्न होती है। इसलिए, बीए 1554 प्रोटीन के बायोफिसायकोकैमिकल विश्लेषण इसकी एनटीपीज़ गतिविधि की पुष्टि करने और इसकी सब्सट्रेट विशिष्टता को समझने के लिए आवश्यक हैं।
यहां, हम एक कदम-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो बीएसएल -3 सुविधा के बिना प्रयोगशालाओं को बी। सीरीस बीसी 1531 जीन के प्रोटीन उत्पाद को चिह्नित करने के लिए अनुसरण कर सकते हैं, जो आणविक स्तर पर बी एन्थ्रेसीस बीए 1554 के एक ortholog है। संक्षेप में, पुनः संयोजक बीसी 1531 (आरबीसी 1531) ई। कोलाई में व्यक्त किया गया था और एक संबंध टैग का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफिक प्रयोगों के लिए, क्रिस्टलीआरबीसी 1531 प्रोटीन की स्थिति की जांच की गई और अनुकूलित किया गया। आरबीसी 1531 की एंजाइमिक गतिविधि का आकलन करने के लिए, एनटीपीस गतिविधि को नियमित रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले रेडियोधी लेबल वाले न्यूक्लियोटाइड्स से बचने के लिए रंगीन तरीके से नजर रखी गई थी। अंत में, प्राप्त बायोफ़िस्कीकेमिकल डेटा के विश्लेषण ने हमें आरबीसी 1531 के ऑलिगोमराइज़ेशन स्टेट और उत्प्रेरक पैरामीटर को निर्धारित करने के साथ-साथ आरबीसी 1531 क्रिस्टल से एक्स-रे विवर्तन डेटा प्राप्त करने के लिए सक्षम किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
पोहांग एक्सेलेरेटर प्रयोगशाला (कोरिया) के बीमलाइन 7 ए में एक्स-रे विवर्तन डेटासेट एकत्र किए गए थे। यह अध्ययन, विज्ञान, आईसीटी और भविष्य योजना मंत्रालय (2015 आर 1 ए 1 ए 001057574 एमएएच) द्वारा वित्त पोषित राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) के माध्यम से प्रशासित बेसिक साइंस रिसर्च कार्यक्रम द्वारा समर्थित था।
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
Riferimenti
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