Rekombinante Protein Expression, Kristallisation und biophysikalische Studien von a<em> Bacillus</em> -konservierte Nucleotid-Pyrophosphorylase, BcMazG
Summary
Bacillus anthracis ist der obligatorische Erreger der tödlichen Inhalations-Milzbrand, so dass Studien über seine Gene und Proteine streng reguliert sind. Ein alternativer Ansatz ist es, orthologe Gene zu untersuchen. Wir beschreiben biophysikochemische Studien eines B. anthracis ortholog in B. cereus , bc1531, die minimale experimentelle Ausrüstung erfordern und keine ernsthaften Sicherheitsbedenken haben.
Abstract
Zur Überwindung von Sicherheitsbeschränkungen und -regelungen beim Studium von Genen und Proteinen aus echten Pathogenen können ihre Homologen untersucht werden. Bacillus anthracis ist ein obligativer Erreger, der tödliche inhalative Milzbrand verursacht. Bacillus cereus gilt als ein nützliches Modell für das Studium B. anthracis aufgrund seiner engen evolutionären Beziehung. Der Gencluster ba1554 – ba1558 von B. anthracis ist mit dem bc1531 – bc1535 – Cluster in B. cereus sowie mit dem bt1364 – bt1368 – Cluster in Bacillus thuringiensis hoch konserviert, was die kritische Rolle der assoziierten Gene in der Bacillus – Gattung anzeigt. Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur Herstellung und Charakterisierung eines Proteinprodukts des ersten Gens ( ba1554 ) aus dem Gencluster di B. anthracis unter Verwendung eines rekombinanten Proteins seines Orthologen in B. cereus , bc1531.
Introduction
Rekombinante Proteinexpression ist weit verbreitet, um Probleme zu lösen, die mit natürlichen Proteinquellen verbunden sind, wie z. B. begrenzte Proteinmengen und schädliche Kontamination. Darüber hinaus kann bei Studien von pathogenen Genen und Proteinen eine alternative Laborstämme, die keine zusätzlichen Sicherheitsvorkehrungen erfordern, genutzt werden. Zum Beispiel ist Bacillus cereus ein nützliches Modell für das Studium der Bacillus anthracis aufgrund ihrer engen evolutionären Beziehung 1 .
B. anthracis ist ein obligativer Erreger, der bei Menschen und Vieh tödlichen inhalativen Milzbrand verursacht und potentiell als Biowaffen verwendet werden kann 2 . So werden Laboruntersuchungen an B. anthracis streng von den US-Zentren für die Krankheitsbekämpfung geregelt, die Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) Praktiken erfordern, die behaupten, dass der Laborbereich mit negativem Raumdruck getrennt wird. Im Gegensatz zu B. anthracis </eM>, B. cereus wird als BSL-1-Agent kategorisiert und hat daher minimale Sicherheitsbedenken. B. cereus ist ein opportunistischer Erreger, der bei der Infektion eine Lebensmittelvergiftung verursacht, die ohne medizinische Hilfe behandelt werden kann. Da aber B. cereus viele kritische Gene mit B. anthracis teilt , können die Funktionen von B. anthracis-Proteinen mit den entsprechenden Homologen von B. cereus 1 untersucht werden.
Der ba1554 – ba1558 – Gencluster von B. anthracis ist mit dem bc1531 – bc1535 – Cluster hoch konserviert Von B. cereus , sowie mit dem bt1364-bt1368- Cluster von Bacillus thuringiensis , in Bezug auf Genorganisation und Sequenz. Weiterhin sind die ersten Gene ( ba1554 , bc1531 und bt1364 ) der jeweiligen Cluster absolut konserviert ( dh 100% Nukleotidsequenzidentität), implyiEine kritische Rolle des Genprodukts in der Bacillus- Spezies. Aufgrund seiner Lage in diesen Genclustern wurde ba1554 als mutmaßlicher Transkriptionsregulator 3 identifiziert. Die Aminosäuresequenzanalyse des ba1554- Produkts zeigt jedoch an, dass es zur MazG-Familie gehört, die eine Nukleotid-Pyrophosphohydrolase-Aktivität aufweist und nicht mit der Transkriptionsfaktor-Aktivität 4 , 5 assoziiert ist. Obwohl Proteine, die zur MazG-Familie gehören, in Bezug auf die Gesamtsequenz und -länge verschieden sind, teilen sie eine gemeinsame MazG-Domäne von 100 Resten, die durch ein EXXE 12-28 EXXD-Motiv charakterisiert ist ("X" steht für jeden Aminosäurerest und die Zahl Gibt die Anzahl der X-Reste an).
Die MazG-Domäne berücksichtigt nicht immer eine bestimmte katalytische Aktivität. Ein MazG-Mitglied aus Escherichia coli (EcMazG) besitzt zwei MazG-Domänen, aber aufDie C-terminale MazG-Domäne ist enzymatisch aktiv 6 . Darüber hinaus variiert die Substratspezifität von MazG-Enzymen von unspezifischen Nukleosidtriphosphaten (für EcMazG) bis zu spezifischem dCTP / dATP (für Integrin-assoziiertes MazG) und dUTP (für dUTPasen) 6 , 7 , 8 , 9 . Daher sind biophysikochemische Analysen des BA1554-Proteins notwendig, um seine NTPase-Aktivität zu bestätigen und seine Substratspezifität zu entschlüsseln.
Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verfügung, dass die meisten Laboratorien ohne BSL-3-Anlage folgen können, um das Proteinprodukt des B. cereus bc1531- Gens zu charakterisieren , das ein Orthologe von B. anthracis ba1554 auf molekularer Ebene ist. Kurz gesagt wurde rekombinantes BC1531 (rBC1531) in E. coli exprimiert und unter Verwendung eines Affinitätsmarkens gereinigt. Für kristallographische Röntgenuntersuchungen wurden die kristallinenZationsbedingungen des rBC1531-Proteins wurden gesiebt und optimiert. Um die enzymatische Aktivität von rBC1531 zu beurteilen, wurde die NTPase-Aktivität kolorimetrisch überwacht, um radioaktiv markierte Nukleotide zu vermeiden, die herkömmlicherweise verwendet wurden. Schließlich ermöglichten die Analysen der erhaltenen biophysikalisch-chemischen Daten, den Oligomerisierungszustand und die katalytischen Parameter von rBC1531 zu bestimmen sowie Röntgenbeugungsdaten aus dem rBC1531-Kristall zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Röntgenbeugungsdatensätze wurden an der Strahllinie 7A des Pohang Accelerator Laboratory (Korea) gesammelt. Diese Studie wurde unterstützt durch die Basic Science Research-Programm durch die National Research Foundation von Korea (NRF), finanziert durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT & Future Planning (2015R1A1A01057574 bis MH) verwaltet.
Materials
| Bacillus cereus ATCC14579 | Korean Collection for Tissue Culture | 3624 | |
| Genomic DNA prep kit | GeneAll | 106-101 | Genomic DNA preparation |
| Forward primer | Macrogen | GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA |
BamHI site is underlined |
| Reverse primer | Macrogen | CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG |
SalI site is underlined |
| nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b expression vector | Novagen | 71463 | Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10 |
| T4 DNA ligase | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB broth (Luria-Bertani) | LPS solution | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Plasmid DNA preparation |
| BL21(DE3) Competent cell | Novagen | 69450-3CN | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS material |
| Potassium chloride | Daejung | 6566-4405 | PBS material |
| Potassium phosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS material |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS material |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics | VCX 130 | |
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Nickel bead |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE protein standard |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie staining solution |
| Methyl alcohol | Samchun chemical | M0585 | Coomassie staining solution |
| Acetic acid | Daejung | 1002-4105 | Coomassie staining solution |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Thrombin | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Size exclusion chromatography |
| Gel filtration standard | Bio-rad | 151-1901 | |
| Centrifugal filter | Amicon | UFC800396 | |
| Crystralization plates | Hampton research | HR3-083 | 96-well sitting drop plate |
| The JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Crystallization secreening solution |
| Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| Cryschem plates | Hampton research | HR3-158 | 24-well sitting drop plate |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma | 10108987001 | |
| Ammonium molybdate solution | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-ascorbic acid | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP substrate | Startagene | 200415-51 | |
| Spectrophotometer | Biotek | SynergyH1 | microplate reader |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad | Prism 5 for Window |
Riferimenti
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