Évaluation de la procédure pour effectuer une cystéromie éveillée dans un modèle de souris
Summary
Cette étude décrit les procédures chirurgicales et les techniques expérimentales pour effectuer une cystométrie éveillée dans une souris qui se déplace librement. En outre, il fournit des preuves expérimentales pour soutenir son optimisation et sa standardisation.
Abstract
La cystométrie de remplissage éveillée a été utilisée pendant longtemps pour évaluer la fonction de la vessie chez les souris qui se déplacent librement, mais les méthodes spécifiques utilisées varient selon les laboratoires. L'objectif de cette étude était de décrire la procédure microchirurgicale utilisée pour implanter un tube intravésical et la technique expérimentale pour l'enregistrement de la pression de la vessie dans une souris éveillée et en mouvement libre. En outre, des données expérimentales sont présentées pour montrer comment la chirurgie, ainsi que le type et la taille du tube, affectent la fonction inférieure du système urinaire et la sensibilité de l'enregistrement. L'effet du diamètre du tube sur l'enregistrement sous pression a été évalué dans des tubes en polyéthylène et en polyuréthane avec des diamètres internes différents. Par la suite, le tube le plus performant des deux matériaux a été implanté chirurgicalement dans le dôme de la vessie de souris mâles C57BL / 6. Une fréquence de miction de douze heures et une nuit a été enregistrée chez des animaux et des animaux sains, intacts 2, 3, 5 et 7 jours après la chirurgie. À la récolte, les vessies wOn a évalué les signes de gonflement en utilisant une observation brute et ont ensuite été traités pour une analyse pathologique. La plus grande étendue du gonflement de la vessie a été observée au jour 2 et 3, ce qui était en corrélation avec les données de mictions comportementales montrant une déficience significative de la fonction de la vessie. Au jour 5, l'histologie de la vessie et la fréquence d'annulation ont été normalisées. Sur la base de la littérature et des preuves fournies par nos études, nous proposons les étapes suivantes pour l' enregistrement in vivo de la pression intravésicale et du volume annulé dans une souris éveillée: 1) Effectuer la chirurgie à l'aide d'un microscope opérationnel et d'outils microchirurgicaux, 2) Utiliser du polyéthylène-10 Tubes pour minimiser les artefacts de mouvement, et 3) Effectuer la cystométrie le jour 5 après l'opération, lorsque le gonflement de la vessie se résout.
Introduction
La cystométrie de remplissage (FC) est une méthode de diagnostic consistant à placer un cathéter dans la vessie pour enregistrer la pression pendant le remplissage lent de la vessie. Introduit en 1927 en tant que méthode de diagnostic clinique pour évaluer la fonction des voies urinaires inférieures, il est resté largement utilisé. 1 Dans les applications de recherche, le FC peut être utilisé pour tester la fonction de la vessie dans des modèles animaux sains et malades et pour étudier les effets des agents pharmacologiques. Les modèles animaux de rongeurs sont couramment utilisés pour étudier la fonction des voies urinaires inférieures. 2 Dans ce groupe de mammifères, le FC a d'abord été développé pour être utilisé chez des rats. 3 Ici, la méthodologie pour implanter un tube dans la vessie et effectuer le FC a été bien décrite et utilisée par de nombreux chercheurs avec un niveau de reproductibilité acceptable. 4 La disponibilité de souches transgéniques et knock-out fait de la souris une espèce précieuse pour de nombreuses zones de recherche,Y compris le domaine du dysfonctionnement des voies urinaires inférieures. La méthodologie utilisée pour effectuer la cystométrie de souris varie sensiblement entre les laboratoires, ce qui rend difficile la comparaison des résultats. 5
Par rapport aux modèles ex vivo , le FC préserve l'anatomie des voies urinaires inférieures, ce qui permet d'évaluer la fonction coordonnée entre la vessie et sa sortie pendant les phases de stockage et de mictions du cycle de la miction. Des recherches antérieures montrent que de nombreux anesthésiques couramment utilisés suppriment la contraction de la miction. Les agents qui préservent la contraction des muscles lisses de la vessie urinaire (uréthane, α-chloralose, kétamine et xylazine), permettant à l'animal de se moudre, réduisent encore considérablement la capacité fonctionnelle de la vessie et suppriment la neurotransmission. 6 , 7 , 8 , 9 Bien que techniquement plus difficile, FC a joué en awLes animaux ambulants conservent l'intégrité fonctionnelle du réflexe de miction.
La fonction des voies urinaires inférieures est influencée par de multiples facteurs, y compris l'enflure post-opératoire de la vessie, le stress dû à la douleur et à l'inconfort et les influences environnementales. L'utilisation d'une technique chirurgicale qui minimise les dommages aux tissus pendant l'implantation du tube et les méthodes d'enregistrement qui réduisent le mouvement du tube, tout en permettant simultanément à l'animal d'ambuler, sont essentielles pour obtenir des enregistrements précis et reproductibles.
Si elle est effectuée de manière adéquate, in vivo Le FC dans les animaux en mouvement libre peut fournir des données qui reflètent fidèlement la fonction physiologique de la vessie. 10 FC dans les animaux en mouvement libre peuvent fournir des données sur les paramètres suivants; Pression basale ou de base: pression minimale entre deux mictions. Pression d'intermittence: pression moyenne entre deux mictions. Pression de seuil: pression intra-survie immAvant la miction. Pression maximale: Pression maximale de la vessie pendant un cycle de miction. Activité spontanée (ou pression oscillatoire moyenne d'interconnexion): pression d'intermittence moins pression basale. Contractions non annulatoires: Augmentation de la pression intravésicale pendant la phase de remplissage, non associée à la libération de fluide. Conformité à la vessie: capacité de la vessie divisée par la pression de seuil moins la pression basale. Fréquence de miction: Nombre de mictions par unité de temps. Intervalle d'intermédiation: Période comprise entre deux pressions annulantes maximales. Capacité de la vessie: volume infusé divisé par le nombre de mictions. Une description détaillée de ces paramètres et de la terminologie standardisée a déjà été publiée. 11
Le FC peut être effectué en utilisant une méthode de perfusion intravésique en continu ou à cycle unique. La cystométrie continue permet d'enregistrer de multiples cycles de miction et de sélectionner des données représentatives baséesSur la reproductibilité. Sa précision dans la mesure de la capacité de la vessie est limitée en raison du volume résiduel inconnu. En outre, il est difficile de collecter de petits volumes annulés (qui, selon la tension et le sexe, varient entre 30 et 184 μL) chez des souris ambulantes. L'utilisation de cette méthode pour enregistrer le volume annulé est moins précise par rapport à une préparation anesthésiée, mais elle est supérieure car elle évite les effets suppressifs des anesthésiques sur la fonction de la vessie. La cystométrie à cycle unique doit être utilisée pour évaluer la capacité de la vessie. Dans cette méthode, la vessie est vidée par aspiration avant la perfusion et la capacité est calculée en fonction de la vitesse de perfusion multiplié par le temps à la pression maximale.
Bien que la technique d'exécution de la cystométrie chez les petits rongeurs ait été publiée, elle décrit la chirurgie effectuée chez un rat et a recommandé que la cystométrie de la souris soit réalisée sous anesthésie uréthane. 10 Le but de cette communication est tO décrire à la fois les techniques microchirurgicales utilisées pour implanter un tube intravésical dans le dôme de la vessie et la mise en place expérimentale utilisée pour enregistrer la fonction du tractus urinaire inférieur, in vivo , lors du remplissage continu de la vessie et de la miction sur une souris éveillée en mouvement libre. De plus, des expériences ont été effectuées pour déterminer comment la longueur, le diamètre et le matériau de la tubulure, ainsi que la méthodologie pour effectuer le FC in vivo , affectent l'enregistrement. Ce protocole expérimental résume les techniques publiées précédemment et propose un certain nombre de modifications basées sur des résultats expérimentaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Matériau optimal et taille du tube intravésiculaire
Pour déterminer l'effet du diamètre du tube sur les enregistrements de pression, nous avons testé différents tubes microfluidiques; PE50 (0,58 mm ID), polyuréthane PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) et PE10 (0,28 mm ID). Pour chaque tube, la pression a été enregistrée avec la pompe à perfusion à 1 mL / h, tout en déplaçant rapidement le tube verticalement de 0 à 30 cm. Les expériences initiales in vivo ont tenté d'ut…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by the Department of Surgery University of Vermont, Danish Council for Independent Research, and by the Odense University Hospital.
Materials
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22ga single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing – Cut to length |
| 22G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100°C) – Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5ml/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2-20X) | Leica Microsystems | Magnification |
Riferimenti
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