마우스 모델에서 깨어나는 방광 측정을 수행하기위한 절차 평가
Summary
이 연구는 자유롭게 움직이는 마우스에서 깨어있는 낭종 측정법을 수행하기위한 수술 절차 및 실험 기술을 설명합니다. 또한 최적화 및 표준화를 지원하는 실험적 증거를 제공합니다.
Abstract
Awake filling cystometry는 자유롭게 움직이는 생쥐에서 방광 기능을 평가하기 위해 오랫동안 사용되어 왔지만 사용 된 특정 방법은 실험실마다 다릅니다. 이 연구의 목적은 깨어 있고 자유롭게 움직이는 마우스에서 방광 내강을 이식하는 데 사용 된 미세 수술 절차와 방광 압력을 기록하기위한 실험 기술을 설명하는 것이 었습니다. 또한, 수술 데이터뿐만 아니라 튜브 유형과 크기가 낮은 요로 기능과 녹음 감도에 영향을 보여주는 실험 데이터가 제공됩니다. 압력 기록에 대한 튜브 지름의 영향은 폴리에틸렌 및 폴리 우레탄 튜브 내에서 상이한 내경을 가지고 평가되었다. 결과적으로 두 재료의 최고 성능 튜브를 수컷 C57BL / 6 마우스 방광의 돔에 외과 적으로 이식 하였다. 수술 후 2, 3, 5, 7 일 동안 건강한 손상되지 않은 동식물에 12 시간 동안 밤새 배뇨 횟수가 기록되었다. 수확시 bladders w총 관찰을 사용하여 부종의 징후를 평가 한 후 병리학 적 분석을 위해 처리했다. 가장 큰 방광 팽창 정도가 2 및 3 일에 관찰되었으며, 이는 방광 기능이 현저하게 손상된 행동 배뇨 데이터와 상관 관계가 있었다. 5 일째, 방광 조직학 및 배뇨 빈도가 정상화되었다. 우리 연구에서 제공 한 문헌 및 증거에 근거하여, 우리는 깨어있는 마우스의 intravesical pressure와 void volume의 생체 내 기록을 위해 다음과 같은 단계를 제안합니다 : 1) 수술 현미경과 미세 수술 도구를 사용하여 수술 수행 2) 폴리에틸렌 -10 3) 수술 후 5 일째 방광 팽창이 해소되었을 때 방광 조영술을 시행하십시오.
Introduction
Filling cystometry (FC)는 방광 충진이 완만 한 동안 압력을 기록하기 위해 카테터를 방광에 삽입하는 진단 방법입니다. 1927 년에 처음으로 하부 요로 기능을 평가하는 임상 진단 방법으로 소개되었지만 널리 사용되었습니다. 연구 응용에서 FC는 건강하고 질병이있는 동물 모델에서 방광 기능을 테스트하고 약리학 적 약제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 설치류 동물 모델은 일반적으로 하부 요로 기능을 조사하는 데 사용됩니다. 2 이 포유류 그룹에서 FC는 처음에는 쥐에서 사용하기 위해 개발되었습니다. 3 방광 내로 튜브를 이식하고 FC를 수행하는 방법은 수용 가능한 수준의 재현성을 가진 많은 연구자들에 의해 잘 기술되고 사용되고있다. 4 트랜스 제닉 및 노크 아웃 균주의 이용 가능성은 수많은 연구 분야에서 쥐를 중요한 종으로 만들고 있으며,하부 요로 기능 장애의 분야를 포함한다. 마우스 방광 측정법을 수행하는 데 사용 된 방법론은 실험실 간 차이가있어 결과를 비교하기가 어렵습니다. 5
생체 외 모델과 비교하여 FC는 하부 요로 조직을 보존하여 배뇨 순환의 저장 및 배뇨 단계를 평가하는 동안 방광과 유출구 사이의 조정 된 기능을 평가할 수 있습니다. 이전의 연구에 따르면 흔히 사용되는 수많은 마취제가 배뇨 수축을 억제합니다. 소변 방광 평활근 수축 (우레탄, 알파 – 클로 라로 오스, 케타민 및 크 실라 진)을 보존하고 동물이 허약 해지도록하는 약제는 기능성 방광 기능을 현저히 감소시키고 신경 전달을 억제합니다. 6 , 7 , 8 , 9 기술적으로 더 도전적이지만, FC는동물을 걷는 것은 배뇨 반사의 기능적 완전성을 보존합니다.
하부 요로 기능은 수술후 방광 벽 팽창, 통증 및 불편 함으로 인한 스트레스 및 환경 영향을 포함한 여러 요인에 의해 영향을받습니다. 튜브 이식시 조직 손상을 최소화하는 외과 기술을 사용하고 튜브 이동을 줄이는 동시에 동물이 자유롭게 움직일 수있게하는 녹음 방법을 사용하면 정확하고 재현성있는 녹음을 얻는 데 필수적입니다.
적절하게 수행되면, 생체 내 자유롭게 움직이는 동물의 FC는 생리적 방광 기능을 확실하게 반영하는 데이터를 제공 할 수 있습니다. 10 자유롭게 움직이는 동물의 FC는 다음 매개 변수에 대한 데이터를 제공 할 수 있습니다. 기초 또는 기준 압력 : 두 개의 저혈압 사이의 최소 압력. Intermicturition pressure : 두 개의 배뇨 사이의 평균 압력. 임계 압력 : Intravesical 압력 imm배뇨 전에 ediately. 최대 압력 : 배뇨 사이클 중 최대 방광 압력. 자발적인 활동 (또는 평균 intermicturition 진동 압력) : intermicturition 압력 마이너스 기초 압력. 보이드가없는 수축 : 유체 방출과 관련이없는 충진 단계에서 방광 내 압력이 증가합니다. 방광 순응도 : 방광 용량을 임계 압력에서 기저 압력을 뺀 값으로 나눈 값. 배뇨 빈도 : 단위 시간당 배뇨 횟수. Intermicturition interval : 두 개의 최대 배뇨 압력 사이의 기간. 방광 용량 : 주입량을 배뇨 횟수로 나눈 값. 이러한 매개 변수 및 표준화 된 용어에 대한 자세한 설명은 이전에 출판되었습니다. 11
FC는 연속 또는 단일주기의 관내 주입 방법을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 지속적인 방광 측정법은 여러 번의 방수 순환을 기록하고재현성에. 방광 용량 측정의 정확도는 잔여 부피가 알려지지 않아 제한적입니다. 또한, 자유롭게 움직이는 생쥐에서 작은 배설물 (30 ~ 184 μL 사이의 변형률 및 성별에 따라 다름)을 수집하는 것은 어렵습니다. 이 방법을 사용하여 기공 량을 기록하는 것은 마취 된 준비에 비해 덜 정확하지만 방광 기능에 대한 마취제의 억제 효과를 피할 수 있다는 점에서 우수합니다. 방광 용량을 평가하기 위해 단일주기 낭종 측정법을 사용해야합니다. 이 방법에서 방광은 주입 전에 흡입에 의해 비워지고 용량은 최대 압력에 대한 시간으로 곱한 주입 속도의 함수로 계산됩니다.
작은 설치류에서 체외 측정법을 수행하는 기술이 발표되었지만 쥐에서 수술이 수행되었으며 우레탄 마취 하에서 마우스 방광 측정이 수행되어야한다고 권고했다. 10 이 의사 소통의 목표는o 방광의 돔에 intravesical tube를 이식하는 데 사용되는 미세 수술 기술과 깨어지며 자유롭게 움직이는 마우스에서 지속적인 방광 충만 및 배뇨 중 하부 요로 기능, 생체 내 기록 실험에 사용되는 실험 설정을 설명합니다. 또한, 생체 내 FC를 수행하는 방법뿐만 아니라 튜빙 길이, 직경 및 재료가 기록에 어떻게 영향을 주는지 실험 하기 위해 수행되었습니다. 이 실험 프로토콜은 이전에 발표 된 기술을 요약하고 실험 결과를 기반으로 많은 수정을 제안합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
intravesical tubing의 최적의 재료와 크기
튜빙의 직경이 압력 기록에 미치는 영향을 결정하기 위해, 우리는 다른 미세 유체 튜브를 테스트했습니다. PE50 (0.58 mm ID), 폴리 우레탄 PU027 (0.4 mm ID), PE25 (0.46 mm ID) 및 PE10 (0.28 mm ID). 각 튜브에 대해 1 mL / h로 작동하는 주입 펌프로 압력을 기록하면서 튜브를 0에서 30 cm까지 수직으로 빠르게 이동 시켰습니다. 초기 생체 내 실험은 PE50 튜빙을 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by the Department of Surgery University of Vermont, Danish Council for Independent Research, and by the Odense University Hospital.
Materials
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22ga single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing – Cut to length |
| 22G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100°C) – Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors – straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5ml/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2-20X) | Leica Microsystems | Magnification |
Riferimenti
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