모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석
Summary
이 프로토콜은 NLS-NES-GFP 단백질의 핵 임포트에서 실시간 변화를 정량화함으로써 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 핵 세포질 수송 속도를 민감하게 측정하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Nucleocytoplasmic 수송은 세포핵에서 큰 분자의 수입과 수출을 의미합니다. 최근 여러 연구에서 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 핵 세포질 경로의 손상이 연관되어 있음이 밝혀졌습니다. ALS는 평균 2 ~ 5 년 내에 마비가되고 궁극적으로 사망에 이르는 운동 신경 세포에 영향을주는 신경 퇴행성 질환입니다. ALS의 대부분의 경우는 산발적이며 명백한 유전 적 연계가 없지만 10 %는 지배적 인 방식으로 유전됩니다. 최근, 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자의 헥사 뉴클레오타이드 반복 확장 (HREs)이 ALS 및 전두 측두엽 치매 (FTD)의 유전 적 원인으로 확인되었다. 중요한 것은, 다른 그룹은 최근 이러한 돌연변이가 nucleocytoplasmic 수송에 영향을 제안했습니다. 이 연구들은 핵 세포질 수송에 대한 HRE에 의해 야기되는 최종 결과와 증상을 대부분 보여 주었지만, 핵 수송 장애를 증명하지는 못했다.실시간. 결과적으로 심각한 핵 세포질 운반체 결핍이 결정될 수 있는데, 이는 대부분 높은 과발현 또는 외인성 단백질 삽입 때문이다.
이 프로토콜은 실시간으로 nucleocytoplasmic 수송 장애를 평가하고 정량화하는 새롭고 매우 민감한 분석을 설명합니다. NLS-NES-GFP 단백질 (shuttle-GFP)의 유입 속도는 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 정량화 할 수 있습니다. 이것은 exportin 억제제를 사용하여 수행되므로 셔틀 GFP 만 핵에 들어갈 수 있습니다. 분석을 검증하기 위해, 이전에 핵 세포질 수송을 방해하는 것으로 밝혀진 C9orf72 HRE 번역 된 디 펩티드 반복체, 폴리 (GR) 및 폴리 (PR)이 사용되었다. 설명 된 분석법을 사용하여, 대조군과 비교하여 핵 수입율이 50 % 감소했다. 이 시스템을 사용하여 nucleocytoplasmic transport의 미세한 변화를 조사 할 수 있으며 nucleustoplasmic tr (심지어 부분적으로)을 구출하는 여러 요소의 능력진단 결함이 결정될 수 있습니다.
Introduction
NPC (nuclear pore complex)는 세포핵 내외로의 큰 분자의 반입 및 반출을 제어합니다. 제 1 규칙없이 핵에 들어갈 수있는 작은 분자와 달리, 더 큰 분자의 수송은 NPC에 의해 강력하게 제어된다. 단백질과 RNA와 같은 이러한 거대 분자는 임 핀틴 (importin)과 엑스 핀틴 (exportins)을 포함한 수송 요소와 연관되어 핵에서 수입되고 수출된다. 수입을 위해서, 단백질은 일반적으로 핵 위치 확인 신호 (NLS)라고 불리는 작은 펩타이드 모티프를 가져야하며, 이것은 임포트린 2 에 의해 결합됩니다. 이러한 아미노산의 배열은 tag로 작용하고 composition 3 , 4 에서 다양합니다. 단백질은 exportin과의 연관 때문에 핵에서 세포질로 내보낼 수 있습니다.일반적으로 핵 수출 신호 (nuclear export signal, NES) 2 라고 불리는 신호 서열에 결합한다. 수입업자와 수출업자 모두 작은 Ras 관련 핵 단백질 GTPase (Ran) 2 의 규제로 인해화물을 운송 할 수 있습니다. Ran은 그것이 GTP 또는 GDP에 결합되어 있는지 여부에 따라 다른 형태의 상태로 존재하는 것으로 나타났습니다. GTP에 바인딩되면 Ran은 importins 또는 exportins에 바인딩 할 수 있습니다. RanGTP에 바인딩되면 수입업자는화물을 방출하고 수출업자는 RanGTP를 묶어 수출화물과 복합체를 형성해야합니다. Ran의 지배적 인 뉴클레오타이드 결합 상태는 핵 (RanGTP) 또는 세포질 (RanGDP)에서의 그의 위치에 의존한다.
최근 많은 연구에서 핵 세포질 경로의 손상과 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 전 측두엽 성 치매 (FTD) 사이의 연관성이 밝혀졌습니다 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런 (MN) 13 모두에 영향을 미치고 평균적으로 2 ~ 5 년 내에 마비와 궁극적으로 사망에 이르는 진행성 및 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다. ALS의 대부분의 경우는 산발적 (SALS)으로 분류되며 명백한 유전 적 연계가 없지만 10 %는 우성 방식 (가족 성 ALS; FALS)으로 유전됩니다. 최근, ALS와 FTD의 유전 적 원인으로 염색체 9 오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자의 헥사 뉴클레오타이드 반복 확장 (HREs)이 14 , 15 로 확인되었다. 이러한 돌연변이는 FALS 사례의 30-40 %를 차지하고 있으며, 여러 연구가 쟁점을 가지고있다핵 세포질 수송에 영향을줌으로써 독성을 유발한다는 것. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
이 연구들은 핵 세포질 수송에 대한 HRE의 최종 결과와 발현을 대부분 보여 주었지만 실시간으로 핵 세포질 파괴를 입증하지 못했습니다. 그 결과 심한 핵 세포질 운반체 결핍이 11 , 17 , 18 에서만 평가되었다.
이 프로토콜은 새롭고실시간으로 nucleocytoplasmic transport dysfunction을 평가하고 정량화하는 민감 분석. NLS-NES-GFP 단백질 (shuttle-GFP)의 유입 속도는 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 정량화 할 수 있습니다. 이것은 이전에 설명한 바와 같이 exportin 억제제를 사용하여 이루어 지므로 셔틀 -GFP 만 핵에 들어갈 수 있습니다. 형광 현미경 및 실시간으로 형광 변화를 정량화 할 수있는 소프트웨어를 사용하여 핵에 위치한 셔틀 -GFP의 형광 강도의 점진적 변화를 정량화 할 수 있습니다. 결과적으로, 임의의 주어진 시간에서 핵 셔틀 -GFP의 양을 나타내는 형광 – 시간 축의 미카엘리스 – 멘틴 (Michaelis-Menten) 형 포화 곡선이 만들어 질 수있다. 곡선의 초기 선형 속도를 사용하여 형광 포화 전에 핵에 들어가는 속도를 나타내는 기울기를 생성 할 수 있습니다.
분석을 확인하기 위해 번역이전에 핵 세포질 수송을 방해한다고보고 된 C9orf72 디 펩티드 반복체, 폴리 (GR) 및 폴리 (PR)은 5 , 7 , 8 , 10 , 12로 사용 되었다. 이 분석법을 사용하여, 대조군에 비해 핵 수입률이 50 % 감소했다. 이 시스템을 사용하여 nucleocytoplasmic 수송의 미세한 변화를 검사 할 수 있습니다. 또한, nucleocytoplasmic 전송 결함을 구출하는 다양한 요인의 능력을 확인할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 nucleocytoplasmic 교통의 미세 변화를 평가하는 매우 민감하고 정량적 인 새로운 분석을 보여줍니다. 이 시스템을 사용하면 단백질 분포에서 극적인 변화를 가져 오는 큰 결함뿐만 아니라 실시간으로 핵 세포질 수송과 그 기능 장애를 관찰하고 측정하는 것이 가능합니다. 이 분석법은 감도 우위를 가질뿐만 아니라 준비가 거의 필요없고 저렴하며 매우 쉽고 낮은 결합 분석법입니다. </p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 AI 실험실의 모든 구성원에게 도움이되는 의견과 제안을 해주신 것에 대해 감사드립니다. 셔틀 -GFP 벡터를 제공 한 Mark Hipp 교수 (Max Planck 생화학 연구소)에 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF # 124 / 14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794), Israel National Psychobiology Institute NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
Riferimenti
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