Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi
Summary
Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.
Abstract
Nükleositoplazmik nakil, büyük moleküllerin hücre çekirdeğinden ithalatı ve ihracını ifade eder. Yakın geçmişte, bir dizi çalışma amyotrofik lateral skleroz (ALS) ile nükleositoplazmik yolakta bozulmalar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir. ALS motor nöronları etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanır ve ölümle sonuçlanır. Çoğu ALS olgusu, herhangi bir görünür genetik bağlantıdan yoksun, dağınıktır, ancak% 10 hakim bir şekilde kalıtsaldır. Yakın zamanda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemesi (HRE), ALS ve frontotemporal bunama (FTD) genetik bir nedeni olarak tanımlandı. Önemli olarak, farklı gruplar yakın zamanda, bu mutantların nükleositoplazmik taşınımı etkilediğini önermişlerdir. Bu çalışmalar çoğunlukla HRE'lerin nükleositoplazmik nakil üzerinde nihai sonucu ve tezahür göstermiştir ancak bunlar nükleer transport bozukluğunu göstermemektedirgerçek zaman. Sonuç olarak, çoğunlukla yüksek aşırı ekspresyon veya eksojen protein yerleştirilmesinden dolayı ciddi nükleositoplazmik ulaşım eksikliği saptanabilir.
Bu protokol, nükleositoplazmik transport bozukluğunun gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesi ve nicelleştirilmesi için yeni ve çok hassas bir tahlil tarif etmektedir. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu bir exportin inhibitörü kullanılarak gerçekleştirilir, böylece GFP'nin mekik içine girmesine izin verilir. Tahlilin geçerliliği için, C9orf72 HRE, daha önce nükleositoplazmik taşınmayı bozduğu gösterilen, poli (GR) ve poli (PR) dipeptid tekrarlarını çevirmiştir. Tanımlanan tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50'lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki küçük değişiklikler incelenebilir ve farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik tr'ini (kısmen bile) kurtarma yeteneği incelenebilirAnsport defekti belirlenebilir.
Introduction
Nükleer gözenek kompleksi (NPC), büyük moleküllerin hücre çekirdeğine girip çıkmasını kontrol eder. Düzenleme 1 olmadan çekirdeğe girebilen küçük moleküllerin aksine, daha büyük moleküllerin taşınması NPC tarafından güçlü bir şekilde kontrol edilir. Proteinler ve RNA gibi bu büyük moleküller, çekirdekten ithal edilecek ve ihraç edilecek olan importinler ve exportinler de dahil olmak üzere ulaşım faktörleri ile ilişkilendirilmektedir. İthal edilmek için, proteinler, genellikle nükleer lokalizasyon sinyali (NLS) olarak adlandırılan ve importins 2 ile bağlanan küçük bir peptid motifi içermelidir. Bu amino asit dizileri bir etiket görevi görür ve 3 , 4 bileşiminde çeşitlilik gösterir. Proteinler, çekirdeğin, exportin ile ilişkisinden dolayı sitoplazmaya ihraç edilebilirS, genellikle bir nükleer ihraç sinyali (NES) 2 olarak adlandırılan bir sinyal sekansını bağlar. Hem importins hem de exportins, küçük Ras ile ilgili nükleer protein GTPase (Ran) 2'nin düzenlenmesi nedeniyle yüklerini taşıyabiliyorlar. Ran'ın, GTP'ye veya GSYİH'ye bağlı olup olmadığına bağlı olarak farklı konformasyonel hallerde bulunduğu gösterilmiştir. GTP'ye bağlandığında, Ran importins veya exportins'e bağlanabilir. Exportins, RanGTP'ye bağlandığında yüklerini serbest bırakırken, exportins'ler ihracat kargolarıyla bir kompleks oluşturmak için RanGTP'yi bağlamalıdır. Ran'ın hakim nükleotid bağlanma durumu, çekirdeğin (RanGTP) veya sitoplazmanın konumuna (RanGDP) bağlıdır.
Son zamanlarda, bir dizi çalışma, nükleositoplazmik yolakta ve hem amiyotrofik lateral sklerozda (ALS) hem de frontotemporal bunama (FTD) 5,6 arasındaki bozukluklar arasında bir bağlantı olduğunu göstermiştir </sup> , 7,8,9,10,11,12 . ALS, hem üst hem de alt motor nöronlarını (MN) etkileyen ve sonuçta ortalama 2-5 yıl içinde felç ile sonuçlanan ilerleyici ve ölümcül nörodejeneratif bir hastalıktır. Çoğu ALS vakası, herhangi bir görünür genetik bağlantı bulunmayan sporadik (SALS) olarak sınıflandırılır, ancak% 10 dominant bir şekilde miras kalır (ailesel ALS; FALS). Son zamanlarda, kromozom 9 açık okuma çerçevesi 72 (C9orf72) genindeki hekzanükleotid tekrar genişlemeleri (HRE), ALS ve FTD'nin genetik bir nedeni olarak 14 , 15 olarak tanımlandı. Bu mutantlar FALS vakalarının% 30-40'ını oluşturur ve farklı çalışmalar iddia edilmiştirNükleositoplazmik taşınımı etkileyerek toksikliğe neden olduklarını, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Bu çalışmalar çoğunlukla HRE'lerin nükleositoplazmik nakil üzerindeki nihai sonuçlarını ve tezahürlerini göstermiştir, ancak gerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik bozulma göstermezler. Sonuç olarak, sadece ağır nükleositoplazmik transport yetersizliği 11 , 17 , 18 olarak değerlendirildi.
Bu protokol yeni ve veGerçek zamanlı olarak nükleositoplazmik transport bozukluğunu değerlendirmek ve ölçmek için hassas duyarlılık testi. Bir NLS-NES-GFP proteini (mekik-GFP) alma oranı, flüoresan mikroskobu kullanılarak gerçek zamanlı olarak nicelleştirilebilir. Bu daha önce tarif edildiği gibi bir exportin inhibitörü kullanılarak yapılır, böylece mekik-GFP'nin çekirdeğe girmesine izin verir. Floresan mikroskopi ve gerçek zamanlı olarak flöresan değişiklikleri nicelikli bir yazılım kullanarak çekirdekte bulunan mekik-GFP'nin flüoresans yoğunluğundaki kademeli değişikliklerin sayısal olarak tespit edilmesi mümkündür. Sonuç olarak, herhangi bir zamanda nükleer mekik-GFP miktarını temsil eden, flüoresan-zaman ekseninin bir Michaelis-Menten benzeri doyum eğrisi yapılabilir. Eğrilerin başlangıçtaki doğrusal oranını kullanarak, flüoresans doygunluğundan önce çekirdeğe girme oranını temsil eden bir eğim oluşturmak mümkündür.
Deneyi doğrulamak için, tercüme etmekDaha önce nükleositoplazmik taşınmayı kesintiye uğrattığı bildirilen poli (GR) ve poli (PR) C9orf72 dipeptide tekrarlar 5 , 7 , 8 , 10 , 12 kullanıldı. Bu tahlil kullanılarak, kontrole kıyasla nükleer ithalat oranında% 50'lik bir düşüş gözlendi. Bu sistemi kullanarak, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişiklikleri incelenebilir. Dahası, farklı faktörlerin bir nükleositoplazmik nakil defekti kurtarma kabiliyeti belirlenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, nükleositoplazmik taşınımdaki dakika değişikliklerini değerlendirmek için oldukça hassas ve niceliksel yeni bir testi gösterir. Bu sistemi kullanarak, protein dağılımında dramatik değişikliklerle sonuçlanan büyük kusurları değil, nükleositoplazmik taşınmayı ve onun işlev bozukluğunu gerçek zamanlı olarak gözlemlemek ve ölçmek mümkündür. Bu tahlil sadece duyarlılık avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda az miktarda hazırlık gerektirir, ucuzdur ve çok kolay ve …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AI laboratuvarının tüm üyelerine yararlı yorumları ve önerileri için teşekkür ederiz. Servis-GFP vektörünü bize sağladığı için Prof. Mark Hipp'e (Max Planck Biyokimya Enstitüsü) teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (ISF # 124/14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Kariyer Entegrasyonu Hibe (CIG # 333794) ve İsrail'de Psikobiyoloji için Ulusal Enstitü ( NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
Riferimenti
- Alberts, B. . Molecular biology of the cell. , (2002).
- Freitas, N., Cunha, C. Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins. Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).
- Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. A short amino acid sequence able to specify nuclear location. Cell. 39, 499-509 (1984).
- la Cour, T., et al. Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals. Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).
- Boeynaems, S., et al. Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD. Sci Rep. 6, 20877 (2016).
- Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 129-133 (2015).
- Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).
- Kwon, I., et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells. Science. 345, 1139-1145 (2014).
- Rossi, S., et al. Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS. J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).
- Shi, K. Y., et al. Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525, 56-61 (2015).
- Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).
- DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72, 245-256 (2011).
- Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72, 257-268 (2011).
- Boeve, B. F., et al. Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72. Brain. 135, 765-783 (2012).
- Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).
- Woerner, A. C., et al. Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA. Science. 351, 173-176 (2016).
- Tao, Z., et al. Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity. Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).
- Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84, 1213-1225 (2014).
