Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.
Abstract
Der nukleozytoplasmatische Transport bezieht sich auf den Import und Export von großen Molekülen aus dem Zellkern. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) und den Beeinträchtigungen im nukleocytoplasmatischen Weg gezeigt. ALS ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die motorischen Neuronen beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich im Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS sind sporadisch, ohne irgendeine offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden in einer dominanten Weise vererbt. Kürzlich wurden Hexanucleotid-Repeat-Expansionen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen als genetische Ursache von ALS und frontotemporaler Demenz (FTD) identifiziert. Wichtig ist, dass verschiedene Gruppen vor kurzem vorgeschlagen haben, dass diese Mutanten den nucleozytoplasmatischen Transport beeinflussen. Diese Studien haben zumeist das endgültige Ergebnis und die Manifestationen, die durch HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport verursacht wurden, gezeigt, aber sie zeigen keine nukleare Transportdysfunktion inEchtzeit. Als Ergebnis kann nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel bestimmt werden, was hauptsächlich auf eine hohe Überexpression oder exogene Proteineinfügung zurückzuführen ist.
Dieses Protokoll beschreibt einen neuen und sehr empfindlichen Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies wird durch die Verwendung eines Exportin-Inhibitors durchgeführt, so dass der Shuttle-GFP nur in den Kern eindringen kann. Zur Validierung des Assays wurden die C9orf72 HRE translatierten Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher gezeigt wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, verwendet. Unter Verwendung des beschriebenen Assays wurde im Vergleich zur Kontrolle eine 50% ige Abnahme der nuklearen Importrate beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen des nucleozytoplasmatischen Transports untersucht und die Fähigkeit verschiedener Faktoren zur Rettung (auch nur teilweise) einer nukleozytoplasmatischen trAnsport-Defekt kann bestimmt werden.
Introduction
Der nukleare Porenkomplex (NPC) kontrolliert den Import und Export von großen Molekülen in und aus dem Zellkern. Im Gegensatz zu kleinen Molekülen, die ohne Regulation 1 in den Kern eindringen können, wird der Transport größerer Moleküle stark vom NPC kontrolliert. Diese großen Moleküle, wie Proteine und RNA, assoziieren mit Transportfaktoren, einschließlich Importins und Exportins, importiert und exportiert aus dem Kern 2 . Um importiert zu werden, müssen Proteine ein kleines Peptidmotiv enthalten, das im Allgemeinen als nukleares Lokalisierungssignal (NLS) bezeichnet wird, das durch Importine 2 gebunden ist. Diese Sequenzen von Aminosäuren wirken als Tag und sind in der Zusammensetzung 3 , 4 verschieden. Proteine können aus dem Kern in das Zytoplasma aufgrund ihrer Assoziation mit Exportin exportiert werdenS, die eine Signalsequenz binden, die allgemein als nukleares Exportsignal (NES) bezeichnet wird 2 . Sowohl Importins als auch Exportins sind in der Lage, ihre Ladung aufgrund der Regulierung des kleinen Ras-verwandten Nuklearproteins GTPase (Ran) 2 zu transportieren. Es wurde gezeigt, dass Ran in verschiedenen Konformationszuständen existiert, je nachdem, ob es an GTP oder BIP gebunden ist. Wenn an GTP gebunden, kann Ran an importins oder exportins binden. Nach der Bindung an RanGTP veröffentlichen die Importine ihre Fracht, während die Exportine RanGTP binden müssen, um einen Komplex mit ihrer Exportfracht zu bilden. Der dominante Nukleotidbindungszustand von Ran hängt von seinem Standort im Kern (RanGTP) oder dem Cytoplasma (RanGDP) ab.
In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen Beeinträchtigungen im nukleozytoplasmatischen Weg und sowohl der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) als auch der frontotemporalen Demenz (FTD) 5 , 6 gezeigt </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS ist eine fortschreitende und tödliche neurodegenerative Erkrankung, die sowohl die oberen als auch die unteren motorischen Neuronen (MNs) 13 beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich zum Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS werden als sporadische (SALS) eingestuft, ohne jede offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden dominant vererbt (familiäres ALS, FALS). Kürzlich wurden Hexanukleotid-Wiederholungserweiterungen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen 14 , 15 als genetische Ursache von ALS und FTD identifiziert. Diese Mutanten machen 30-40% der FALS-Fälle aus, und verschiedene Studien haben behauptetDass sie eine Toxizität durch Beeinträchtigung des nucleozytoplasmatischen Transports verursachen 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Diese Studien haben zumeist die endgültigen Ergebnisse und Manifestationen von HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport gezeigt, aber sie zeigen keine nukleocytoplasmatische Störung in Echtzeit. Infolgedessen wurde nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel 11 , 17 , 18 untersucht.
Dieses Protokoll beschreibt eine neue und veRy-sensitiven Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies geschieht unter Verwendung eines Exportin-Inhibitors, wie zuvor beschrieben, so daß der Shuttle-GFP nur in den Kern gelangen kann. Mit der Fluoreszenzmikroskopie und einer Software, die in der Lage ist, Fluoreszenzveränderungen in Echtzeit zu quantifizieren, ist es möglich, allmähliche Änderungen der Fluoreszenzintensität des im Zellkern befindlichen Shuttle-GFP zu quantifizieren. Als Ergebnis kann eine Michaelis-Menten-ähnliche Sättigungskurve der Fluoreszenz-zu-Zeit-Achse, die die Menge an nuklearem Shuttle-GFP zu irgendeiner gegebenen Zeit darstellt, hergestellt werden. Durch die Verwendung der anfänglichen linearen Geschwindigkeit der Kurven ist es möglich, eine Steigung zu erzeugen, die die Eintrittsrate in den Kern vor der Fluoreszenzsättigung darstellt.
Um den Test zu validieren, das übersetzenD C9orf72 Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher berichtet wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, wurden 5 , 7 , 8 , 10 , 12 verwendet. Unter Verwendung dieses Assays wurde eine 50% ige Abnahme der nuklearen Einfuhrrate im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport untersucht werden. Darüber hinaus kann die Fähigkeit verschiedener Faktoren, einen nukleozytoplasmatischen Transportdefekt zu retten, bestimmt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll zeigt einen hochempfindlichen und quantitativen neuen Assay, um winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport zu bewerten. Mit diesem System ist es möglich, den nucleozytoplasmatischen Transport und seine Dysfunktion in Echtzeit zu beobachten und zu messen, nicht nur große Defekte, die zu dramatischen Veränderungen der Proteinverteilung führen. Dieser Assay hat nicht nur einen Sensitivitätsvorteil, sondern erfordert auch wenig Vorbereitung, ist preiswert und ist ein sehr einfacher und…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Mitgliedern des AI-Labors für ihre hilfreichen Kommentare und Anregungen. Wir danken Prof. Mark Hipp (Max-Planck-Institut für Biochemie) für die Bereitstellung des Shuttle-GFP-Vektors. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der israelischen Wissenschaftsstiftung (ISF # 124/14), der Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Karriere Integration Grant (CIG # 333794) und dem Nationalen Institut für Psychobiologie in Israel ( NIPI # b133-14 / 15).
Materials
| Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
| DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
| FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
| Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
| Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
| TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
| Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
| IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
| Leptomycin B | Sigma | L2913 |
| PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
| Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp | Glas-Col | 099C K5424CE |
| MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |
Riferimenti
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