यह प्रोटोकॉल एक एनएलएस-एनईएस-जीएफ़पी प्रोटीन के परमाणु आयात में वास्तविक समय में बदलाव को बढ़ाकर मोटर न्यूरॉन जैसी एनएससी -34 कोशिकाओं के भीतर न्यूक्लूसियोप्लास्मिस्टिक ट्रांसपोर्ट रेट को संवेदनशील तरीके से मापने के लिए एक विधि का वर्णन करता है।
न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन सेल नाभिक से बड़े अणुओं के आयात और निर्यात को संदर्भित करता है। हाल ही में, कई अध्ययनों में एमीयोथ्रोफिक पार्श्व स्केलेरोसिस (एएलएस) और न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मेक मार्ग में हानि के बीच एक कनेक्शन दिखाया गया है। एएलएस मोटर न्यूरॉन्स को प्रभावित करने वाली एक neurodegenerative रोग है और जिसके परिणामस्वरूप पक्षाघात और अंततः मृत्यु में, औसतन 2-5 वर्षों के भीतर। ए एल एस के अधिकांश मामलों छिटपुट हैं, जो किसी भी स्पष्ट आनुवंशिक संबंध की कमी है, लेकिन 10% एक प्रभावी तरीके से विरासत में मिला है। हाल ही में, क्रोमोज़म 9 खुले पढ़ने के फ्रेम 72 (सी 9orf72) जीन में हेक्सान्यूक्लियोटाइड दोहराए विस्तार (एचआरई) की पहचान एएलएस और फ्रंटोटेमपोरल डिमेंशिया (एफटीडी) के आनुवंशिक कारण के रूप में की गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, विभिन्न समूहों ने हाल ही में प्रस्तावित किया है कि ये म्यूटेंट न्यूक्लूसोसाइटोप्लास्मिक परिवहन को प्रभावित करते हैं। इन अध्ययनों में ज्यादातर न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन पर एचआरई की वजह से अंतिम परिणाम और अभिव्यक्तियों को दिखाया गया है, लेकिन वे परमाणु परिवहन संबंधी समस्या का प्रदर्शन नहीं करते हैंरियल टाइम। नतीजतन, केवल गंभीर न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन की कमी का निर्धारण किया जा सकता है, अधिकतर उच्च ओवर एक्सप्रेसन या बहिर्जात प्रोटीन प्रविष्टि के कारण।
यह प्रोटोकॉल वास्तविक समय में न्यूक्लोकॉस्प्टोस्लॉजिकिक ट्रांसफिकेशन डिस्फ़क्शन के मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक नया और बहुत ही संवेदनशील परख का वर्णन करता है। एक एनएलएस-एनईएस-जीएफपी प्रोटीन (शटल-जीएफपी) के आयात की दर को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में मापा जा सकता है। यह एक निर्यातिन अवरोधक का उपयोग करके किया जाता है, जिससे शटल जीएफपी केवल नाभिक में प्रवेश करने की अनुमति देता है। परख को मान्य करने के लिए, C9orf72 एचआरई अनुवादित दोहराव दोहराता है, पाली (जीआर) और पाली (पीआर), जो पहले से न्यूक्लियोकॉप्टोस्लैमिक परिवहन को बाधित करने के लिए दिखाया गया था, का उपयोग किया गया था। वर्णित परख का उपयोग, नियंत्रण की तुलना में परमाणु आयात दर में 50% कमी देखी गई। इस प्रणाली का उपयोग करते हुए, न्यूक्लूसोप्टोस्लैमिक परिवहन में मिनट के परिवर्तन की जांच की जा सकती है और विभिन्न कारकों की क्षमता (यहां तक कि आंशिक रूप से) एक न्यूक्लियोक्साइटप्लास्मिक ट्रAnsport दोष निर्धारित किया जा सकता है
परमाणु ताकना जटिल (एनपीसी) सेल नाभिक में और बाहर बड़े अणुओं के आयात और निर्यात को नियंत्रित करता है। छोटे अणुओं के विपरीत, जो विनियमन 1 के बिना नाभिक में प्रवेश कर सकते हैं, बड़े अणुओं के परिवहन को एनपीसी द्वारा दृढ़ता से नियंत्रित किया जाता है। इन बड़े अणुओं जैसे कि प्रोटीन और आरएनए, आयातकों और निर्यातकों सहित परिवहन कारकों के साथ सहयोगी, को नाभिक 2 से आयात और निर्यात किया जा सकता है। आयात करने के लिए, प्रोटीन में एक छोटा पेप्टाइड आकृति होती है, जिसे आम तौर पर एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) कहा जाता है, जो कि आयातकों द्वारा बाध्य होती है 2 । एमिनो एसिड के ये अनुक्रम एक टैग के रूप में कार्य करते हैं और रचना 3 , 4 में विविध हैं। निर्यातक के साथ उनके सहयोग के कारण प्रोटीन को नाभिक से सीओप्लाज्म में निर्यात किया जा सकता हैएस, जो एक सिग्नल अनुक्रम बाँधते हैं, जिसे आम तौर पर परमाणु निर्यात संकेत (एनईएस) 2 कहा जाता है छोटे रास से संबंधित परमाणु प्रोटीन जीटीपेज (रेन) 2 के विनियमन के कारण आयातकों और निर्यातकों दोनों ही अपने माल को परिवहन में सक्षम हैं। विभिन्न गठनात्मक राज्यों में चलने का अस्तित्व दिखाया गया है, इस पर निर्भर करता है कि क्या वह जीटीपी या जीडीपी के लिए बाध्य है या नहीं। जब जीटीपी के लिए बाध्य है, तो रन आयातकों या निर्यातकों से जुड़ा हो सकता है। रान जीटीपी के लिए बंधन पर आयातकों ने अपना माल छोड़ दिया, जबकि निर्यातकों को अपने निर्यात कार्गो के साथ एक जटिल बनाने के लिए रान जीटीपी को बाध्य करना चाहिए। प्रमुख न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी स्थिति, नाभिक (RanGTP) या साइटोप्लाज्म (रानजीडीपी) में अपने स्थान पर निर्भर करती है।
हाल ही में, कई अध्ययनों से न्यूक्लोकॉटेप्लस्मेक मार्ग में अपर्याप्तता और दोनों एमीट्रोफिक पार्श्व कैंसर (एएलएस) और फ्रंटोटेमपोरल डिमेंशिया (एफटीडी) 5 , 6 </sup> , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 एएलएस एक प्रगतिशील और घातक neurodegenerative रोग दोनों ऊपरी और निचले मोटर न्यूरॉन्स (एमएनएस) 13 को प्रभावित करता है और जिसके परिणामस्वरूप पक्षाघात और अंततः मृत्यु में, औसतन 2-5 वर्षों के भीतर। एएलएस के अधिकांश मामलों को छिटपुट (एसएएलएस) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, जिसमें कोई भी स्पष्ट आनुवंशिक संबंध नहीं होता है, लेकिन 10% एक प्रभावी तरीके से विरासत में मिला है (पारिवारिक एएलएस; FALS)। हाल ही में, क्रोमोज़म 9 खुले पढ़ने के फ्रेम 72 (सी 9orf72) जीन में हेक्साएनक्लियोटाइड दोहराए विस्तार (एचआरई) 14 , 15 को एएलएस और एफटीडीए के आनुवांशिक कारण के रूप में पहचाने गए थे। इन म्यूटेंट के कारण फलों के मामलों के 30-40% मामलों 16 के लिए है , और विभिन्न अध्ययनों का तर्क हैकि वे न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 को प्रभावित करके विषाक्तता का कारण बनाते हैं।
इन अध्ययनों में ज्यादातर न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन पर एचआरई के अंतिम परिणाम और अभिव्यक्तियों को दिखाया गया है, लेकिन वे वास्तविक समय में न्यूक्लियोक्साइटप्लाज्मिक व्यवधान का प्रदर्शन नहीं करते हैं। नतीजतन, केवल गंभीर न्यूक्लोकोसाइटोप्लास्मिक परिवहन की कमी 11 , 17 , 18 का मूल्यांकन किया गया है।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक नया और veवास्तविक समय में न्यूक्लोकॉस्प्टोस्लॉजिकिक ट्रांसफिकेशन डिसिंकक्शन का मूल्यांकन और मात्रा निर्धारित करने के लिए संवेदनशील संवेदनशील परीक्षण। एक एनएलएस-एनईएस-जीएफपी प्रोटीन (शटल-जीएफपी) के आयात की दर को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके वास्तविक समय में मापा जा सकता है। यह एक निर्यातिन अवरोधक का उपयोग किया जाता है, जैसा कि पहले 18 वर्णित है, इस प्रकार शटल-जीएफ़पी को केवल नाभिक में प्रवेश करने की इजाजत देता है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट परिवर्तनों को मापने में सक्षम एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यह नाभिक में स्थित शटल-जीएफपी की प्रतिदीप्ति तीव्रता में क्रमिक परिवर्तनों को मापना संभव है। नतीजतन, किसी भी समय पर परमाणु शटल-जीएफपी की मात्रा का प्रतिनिधित्व करने वाली प्रतिदीप्ति-टू-टाइम अक्ष का एक माइकलिस-मेन्टन-जैसी संतृप्ति वक्र, बनाया जा सकता है। घटता की प्रारंभिक रैखिक दर का उपयोग करके, एक ढलान उत्पन्न करना संभव है, जो प्रतिदीप्ति संतृप्ति से पहले नाभिक में प्रवेश की दर को दर्शाता है।
परख को मान्य करने के लिए, अनुवादडी C9orf72 dipeptide दोहराता है, पाली (जीआर) और पाली (पीआर), जो पहले न्यूक्लूसोप्लास्मिक परिवहन को बाधित करने के लिए सूचित किया गया था, 5 , 7 , 8 , 10 , 12 का इस्तेमाल किया गया था। इस परख का उपयोग, नियंत्रण की तुलना में परमाणु आयात दर में 50% कमी देखी गई। इस प्रणाली का उपयोग करना, न्यूक्लूसोप्लास्मेक परिवहन में मिनट के परिवर्तन की जांच हो सकती है। इसके अलावा, एक न्युक्लोकॉस्प्टोस्मेस्की परिवहन दोष को बचाव करने के लिए विभिन्न कारकों की क्षमता निर्धारित की जा सकती है।
यह प्रोटोकॉल एक बेहद संवेदनशील और मात्रात्मक नई परख को दर्शाता है जो कि न्यूक्लियोकॉप्टोस्लास्मिक परिवहन में मिनट के परिवर्तनों का मूल्यांकन करता है। इस प्रणाली का प्रयोग करके, वास्तविक समय में न्य…
The authors have nothing to disclose.
हम अपने सहायक टिप्पणियों और सुझावों के लिए एआई प्रयोगशाला के सभी सदस्यों का धन्यवाद करते हैं। हम शटल-जीएफपी वेक्टर प्रदान करने के लिए प्रो। मार्क हिप्प (जैक्सैमिस्ट्री के मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस काम को इज़राइली साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ # 124/14), बिजनेस साइंस फाउंडेशन (बीएसएफ # 2013325), एफपी 7 मैरी क्यूरी कैरियर इंटीग्रेशन ग्रांट (सीआईजी # 3337 9 4), और इसराइल में मनोवैज्ञानिक के लिए राष्ट्रीय संस्थान एनआईपीआई # बी 133-14 / 15)
Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34) | tebu-bio | CLU140-A |
DMEM 4.5g/L L-glucose | Biological Industries | 01-055-1A |
FBS European Grade | Biological Industries | 04-007-1A |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 |
Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3111 |
Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm | Bar Naor LTD | |
TurboFect Transfection Reagent | Thermo Scientific | R0531 |
Axiovert 100 inverted microscope | Zeiss | |
IMAGING WORKBENCH 2 | Axon Instruments | |
Leptomycin B | Sigma | L2913 |
PBS | Biological Industries | 02-023-1A |
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MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002455 |