यह प्रोटोकॉल कार्यात्मक मिटोकोन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन कॉम्प्लेक्स (सीएक्स) चतुर्थ और अलग-अलग सुपर-कॉम्प्लेक्सेज को अलग-अलग वर्णित करता है, जो उनके विधानसभा और संरचना के बारे में जानकारी प्रकट करने के लिए देशी वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करते हैं। मूल जेल को इम्यूनोबलॉटिंग, इन-जेल एशेज के अधीन किया जा सकता है, और अलग-अलग कॉम्प्लेक्स की विशेषता के लिए इलेक्ट्रोलाइजेशन द्वारा शुद्धिकरण किया जा सकता है।
मितोचोन्द्रीयल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी) विभिन्न ईंधन के टूटने से प्राप्त सेल, एटीपी की बायोएनेजरेटिक मुद्रा में ऊर्जा को बदल देती है। ईटीसी 5 विशाल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स से बना है, जो सुपर-कॉम्प्लेक्ज़िस (सीआई, सी-III, और सी -4) तथा सिन्थोसोम (सीवी) नामक सुपर कॉम्पलेक्स में इकट्ठा होता है जो इलेक्ट्रॉन परिवहन और एटीपी उत्पादन की दक्षता में वृद्धि करता है। ईटीसी कार्य को मापने के लिए 50 से अधिक वर्षों के लिए विभिन्न तरीकों का इस्तेमाल किया गया है, लेकिन ये प्रोटोकॉल अलग-अलग कॉम्प्लेक्स और सुपर कॉम्प्लेक्सस की विधानसभा के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है। इस प्रोटोकॉल में मूल जेल पॉलिैक्लाइमाइड जेल वैद्युतकणसंच (पेज) की तकनीक का वर्णन किया गया है, जो एक विधि है जो 20 से अधिक साल पहले ईटीसी जटिल संरचना का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया था। देशी वैद्युतकणसंचिकित्सा ईटीसी परिसरों के अपने सक्रिय रूपों में अलग होने की अनुमति देता है, और इन परिसरों को फिर से इम्यूनोबलॉटिंग, इन-जेल एसेज़ (आईजीए) और इलेक्ट्रोलाउशन द्वारा शुद्धि के जरिये अध्ययन किया जा सकता है। फिर से संयोजन करकेअन्य मितोचोन्ड्रियल assays के साथ देशी जेल पेज की, यह ईटीसी गतिविधि, इसकी गतिशील विधानसभा और disassembly की एक पूर्ण चित्र प्राप्त करना और यह कैसे मिटोकोंड्रियल संरचना और कार्य को विनियमित करना संभव है। यह काम इन तकनीकों की सीमाओं पर भी चर्चा करेगा। संक्षेप में, मूल पृष्ठ की तकनीक, नीचे दी गई इम्यूनोबलॉटिंग, आईजीए, और इलेक्ट्रोलाउशन द्वारा प्रस्तुत की गई, यह एक शक्तिशाली तरीका है जो मितोचोन्ड्रियल ईटीसी सुपर कॉम्पलेक्सेज़ की कार्यक्षमता और संरचना की जांच करता है।
एटीपी के रूप में मिटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा केवल सेल के अस्तित्व के लिए आवश्यक नहीं है, बल्कि सेल मृत्यु के नियमन के लिए भी है। ऑक्सीडेटिव फास्फोरेटेशन द्वारा एटीपी की पीढ़ी को एक कार्यात्मक इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी, सीएक्स-आई टू टूवीं) और मिटोकोडायड्रियल एटीपी सिंथेस (सीएक्स-वी) की आवश्यकता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि इन बड़े प्रोटीन परिसरों को सुपर-कॉम्प्लेक्स में संयोजित किया जाता है, जिसे श्वासरोग और सिंथेसाम्स 1 , 2 कहा जाता है। इन बड़े परिसरों और सुपर कॉम्पलेक्सेज़ के असेंबली, गतिशीलता और गतिविधि विनियमन का विश्लेषण करना चुनौतीपूर्ण है जबकि एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के साथ ऑक्सीजन की खपत माप और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करते हुए एंजाइम assays ईटीसी जटिल गतिविधि के बारे में बहुमूल्य जानकारी दे सकते हैं, इन assays प्रोटीन जटिल या supercomplexes की उपस्थिति, आकार, और उप-संयोजन के बारे में जानकारी प्रदान नहीं कर सकता। हालांकि, नीले और स्पष्ट देशी (बीएन और सीएन, क्रमशः) पृष्ठ 3 ने जटिल संरचना और विधानसभा / disassembly के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी और शारीरिक और रोग परिस्थितियों के तहत इन महत्वपूर्ण श्वसन परिसरों के सुप्रामोलेकुलर संगठन के गतिशील विनियमन के बारे में खुलासा करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाया है।
उच्च संक्रामक सुपर कॉम्पलेक्सेज़ में इन परिसरों की विधानसभा में मिटोकॉन्ड्रियल संरचना और 5 फ़ंक्शन को विनियमित करने के लिए प्रतीत होता है। उदाहरण के लिए, श्वासशोथ विधानसभा, इलेक्ट्रो ट्रान्सफर की दक्षता और मिटोकोन्ड्रियल आंत झिल्ली 5 में प्रोटॉन प्रेरक बल की पैदावार को बढ़ाती है। इसके अलावा, सिंथासोमों की विधानसभा में एटीपी उत्पादन की दक्षता और कोशिकाप्लाज्म 2 में ऊर्जा समकक्षों का हस्तांतरण न केवल बढ़ता है, बल्कि यह ट्यूबलर क्रिस्टे 6 में मिटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली भी बनाता है , </ Sup> 7 माउस भ्रूणों में कार्डियक विकास के दौरान सुपरकम्पलेक्स असेंबली का अध्ययन दर्शाता है कि सीएक्स-आई की हालत में सुपरकॉम्प्लेक्सेज की पीढ़ी भ्रूण दिवस 13.5 8 के बारे में शुरू होती है। दूसरों ने दिखाया है कि उम्र बढ़ने या ischemia / reperfusion चोटों 9 , 10 या neurodegenerative बीमारियों 11 की प्रगति में एक भूमिका निभा सकते हैं के कारण हृदय में सीएक्स-आई युक्त supercomplexes की मात्रा कम हो जाती है।
यह प्रोटोकॉल मूल जेल पृष्ठ के लिए विधियों का वर्णन करता है जिसका उपयोग विधानसभा की जांच के लिए किया जा सकता है और ईटीसी कॉम्प्लेक्स और सुपर कॉम्पलेक्सेज़ की गतिविधि के लिए किया जा सकता है। मिटोकॉन्ड्रियल सुपर कॉम्प्लेक्स का अनुमानित आणविक भार का मूल्यांकन सीएन या बीएन पॉलीएक्लाइमाइड जैल में प्रोटीन परिसरों को अलग करके किया जा सकता है। सीएन पृष्ठ भी जेल में सीधे सभी मिटोकोडायड्रियल परिसरों की एंजाइमिक गतिविधि के दृश्य के लिए अनुमति देता है (इन-जेल एशेज;आईजीए) 12 यह काम IX के माध्यम से एनएडीएच के ऑक्सीकरण को सीएक्स-आई की क्षमता को हाइलाइट करने और आईजीए द्वारा सीएक्स-वी की एटीपी-हाइड्रोलाइजिंग गतिविधि की वजह से सिंथासॉम की उपस्थिति को दर्शाता है। प्रोटीन को नाइट्रॉसेल्यूलोज़ झिल्ली पर स्थानांतरित करके और इम्यूनोबलॉटिंग करने से सीएक्स-आई और सीएक्स-वी युक्त कई कॉम्प्लेक्स और सुपर कॉम्प्लेक्स भी प्रदर्शित किए जा सकते हैं। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि बीएन या सीएन पृष्ठ आमतौर पर उनके शारीरिक आकार और रचना के आधार पर प्रोटीन परिसरों को अलग करता है; एक झिल्ली के लिए स्थानांतरण बैंड के इस पैटर्न को बरकरार रखता है। बीएन या सीएन पृष्ठ में प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण भी 2 डी पृष्ठ (प्रदर्शन के लिए फियाला एट अल। 13 देखें) या सुक्रोज घनत्व केन्द्रापसारक 14 , 15 द्वारा किया जा सकता है । आगे एक विशिष्ट बैंड का विश्लेषण करने के लिए, इसे BN पृष्ठ से excised किया जा सकता है, और इस प्रोटीन जटिल से प्रोटीन purifie हो सकता हैघ उन्हें मूल स्थितियों के तहत electroeluting द्वारा। देशी इलेक्ट्रोलाशन कुछ घंटों के भीतर किया जा सकता है, जो आसपास के बफर में एक जेल से निष्क्रिय प्रसार (संदर्भ 16 में प्रयुक्त होता है) के लिए महत्वपूर्ण अंतर बना सकता है।
संक्षेप में, इन विधियों का वर्णन कई तरीकों से होता है जो मिटोकोन्ड्रियल झिल्ली से उच्च-आणविक-वजन सुपर कॉम्प्लेक्स के आगे लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं।
मिटोकॉन्ड्रियल एटीपी पीढ़ी के लिए एक कार्यात्मक ईटीसी आवश्यक है। ईटीसी के परिसरों में दो प्रकार के सुपर कॉम्प्लेक्स हैं: श्वसनसॉम्स (सीएक्स-आई, -III, और -IV) 1 और सिंथेसाम्स (सीएक्स-वी) 2 । प?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के संस्थापक के संबद्ध [12GRNT12060233] और रोचेस्टर विश्वविद्यालय में मजबूत बच्चों के अनुसंधान केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित था।
Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
Glycine | Sigma | G7403 | |
SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
Tricine | Sigma | T0377 | |
Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
EDTA | Sigma | E5134 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
NADH | Sigma | N4505 | |
Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
Tris HCL | Sigma | T3253 | |
ATP | Sigma | A2383 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ponceau S | Sigma | P3504 | |
anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
BSA | |||
sodium chloride | Sigma | S9888 | |
potassium chloride | Sigma | P9541 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |