ネイティブ電気泳動、インゲルアッセイおよび電気溶出を用いたミトコンドリア電子輸送鎖のスーパーコンプレックスの解析
Summary
このプロトコールは、機能的ミトコンドリア電子輸送鎖複合体（Cx）IVおよびそれらのスーパーコンプレックスの、それらのアセンブリおよび構造に関する情報を明らかにするための天然の電気泳動の分離を記載する。天然ゲルは、イムノブロッティング、ゲル内アッセイ、および電気溶出による精製を受けて、個々の複合体をさらに特徴付けることができる。
Abstract
ミトコンドリア電子輸送鎖（ETC）は、様々な燃料の分解から誘導されたエネルギーを細胞のATPの生体エネルギー通貨に変換する。 ETCは、レスピラソーム（CI、C-III、およびC-IV）と呼ばれるスーパーコンプレックスと、電子輸送およびATP産生の効率を高めるシンターソーム（CV）にアセンブルする5つの巨大タンパク質複合体からなる。 ETC機能を測定するために50年以上にわたって様々な方法が用いられてきたが、これらのプロトコルは個々の複合体およびスーパーコンプレックスの集合に関する情報を提供しない。このプロトコールは、ETC複合体構造を研究するために20年以上前に改変された方法であるネイティブゲルポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）の技術を記載している。ネイティブ電気泳動は、ETC複合体の活性型への分離を可能にし、イムノブロッティング、インゲルアッセイ（IGA）、および電気溶出による精製を用いてこれらの複合体を研究することができる。また、ネイティブゲルPAGEの他のミトコンドリアアッセイの結果と比較すると、ETC活性、その動的なアセンブリおよび分解、およびこれがミトコンドリアの構造および機能をどのように調節するかについてのコンプリータ画像を得ることが可能である。この作業では、これらの技術の限界についても検討する予定です。要約すると、以下に示すイムノブロッティング、IGA、および電気溶出が続くネイティブPAGEの技法は、ミトコンドリアETCスーパーコンプレックスの機能性および組成を調べる強力な方法である。
Introduction
ATPの形態のミトコンドリアのエネルギーは、細胞生存に必須であるだけでなく、細胞死の調節にも必須である。酸化的リン酸化によるATPの生成には、機能的電子伝達鎖（ETC; Cx-1〜IV）およびミトコンドリアATPシンターゼ（Cx-V）が必要である。最近の研究は、これらの大きなタンパク質複合体が、レスピラソームおよびシンセサム1,2と呼ばれるスーパーコンプレックスに組織化されていることを示している。これらの大規模な複合体およびスーパーコンプレックスのアセンブリ、ダイナミクス、およびアクティビティの規制を分析することは困難です。分光光度計を用いて実施された酸素電極および酵素アッセイを用いた酸素消費測定はETC複合体活性に関する貴重な情報を与えることができるが、これらのアッセイはタンパク質複合体または関連するスーパーコンプレックスの存在、サイズおよびサブユニット組成に関する情報を提供することができない。しかし、青色で透明なネイティブ（BNおよびCN）PAGE 3は、複雑な組成およびアセンブリ/分解に関する重要な情報、ならびに生理学的および病理学的条件下でのこれらの生命を脅かす呼吸器複合体の超分子構成の動的調節に関する強力なツールを創出した4 。
これらの複合体を高次スーパーコンプレックスに集合させることは、ミトコンドリア構造および機能を調節するようである5 。例えば、レスピアソームアセンブリは、電子伝達の効率およびミトコンドリア内膜5にわたるプロトン原動力の生成を増加させる。さらに、シンサソームの集合体は、ATP産生の効率および細胞質2へのエネルギー等価物の移動を増加させるだけでなく、ミトコンドリア内膜を管状クリステイ6 、/ u> 7 。マウス胚における心臓発達中のスーパーコンプレックス集合体の研究は、心臓におけるCx-1含有スーパーコンプレックスの発生が、およそ胚の13。 8日に始まることを示している。他は、Cx-I含有スーパーコンプレックスの量が、老化または虚血/再かん流傷害のために心臓において減少すること、 9,10 、または神経変性疾患の進行に役割を果たす可能性があることを示している11 。
このプロトコールは、ETC複合体およびスーパーコンプレックスのアセンブリおよび活性を調べるために用いることができる天然のゲルPAGEのための方法を記載する。ミトコンドリアのスーパーコンプレックスのおおよその分子量は、CNまたはBNポリアクリルアミドゲル中のタンパク質複合体を分離することによって評価することができる。 CN PAGEはまた、ゲル中で直接的に全てのミトコンドリア複合体の酵素活性の可視化を可能にする（in-gelアッセイ;IGA） 12 。この研究は、IGAを介してNADHを酸化するCx-Iの能力およびIGAによるCx-VのATP加水分解活性に起因するシンサソームの存在を強調することによって、呼吸器の活性を実証している。 Cx-IおよびCx-Vを含む複数の複合体およびスーパー複合体はまた、タンパク質をニトロセルロース膜上に移し、イムノブロッティングを行うことによって実証することができる。このアプローチの利点は、BNまたはCN PAGEが一般に、それらの生理学的サイズおよび組成に基づいてタンパク質複合体を分離することである。膜への移動はこのバンドのパターンを保持する。 BNまたはCN PAGEにおけるタンパク質複合体の分析は、2D-PAGE（デモンストレーションのためにFiala ら 13参照）またはショ糖密度遠心分離14,15を用いて行うこともできる。特定のバンドをさらに分析するために、それをBN PAGEから切り出すことができ、このタンパク質複合体からのタンパク質を精製することができるそれらを自然条件下で電気溶出することにより、ネイティブの電気溶出は数時間以内に行うことができ、ゲルから周囲のバッファーへのタンパク質の受動拡散（参考文献16で使用されているような）に有意差を生じさせる可能性がある。
要約すると、これらの方法は、ミトコンドリア膜からの高分子量スーパーコンプレックスのさらなる特徴付けを可能にするいくつかのアプローチを記載する。
Protocol
Representative Results
Discussion
機能的ETCは、ミトコンドリアATP生成に必要である。 ETCの複合体は、respirasomes（Cx-1、-III、-IV） 1とシンターソーム（Cx-V） 2の2種類のスーパーコンプレックスを形成することができます。 ETCをスーパーコンプレックスに編成することは、ETC全体の効率を向上させると考えられている5,22。これらのスーパーコンプレックスがどのように組み立てられ分解され?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、米国心臓協会創設者のアフィリエイト[12GRNT12060233]およびロチェスター大学の強力な児童研究センターからの助成金によって支えられました。
Materials
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCL | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
References
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