Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Trennung von funktionellen mitochondrialen Elektronentransportkettenkomplexen (Cx) IV und deren Superkomplexe unter Verwendung der nativen Elektrophorese, um Informationen über deren Zusammenbau und Struktur zu zeigen. Das native Gel kann Immunoblotting, In-Gel-Assays und Reinigung durch Elektroelution unterworfen werden, um einzelne Komplexe weiter zu charakterisieren.
Abstract
Die mitochondriale Elektronentransportkette (ETC) transduziert die aus dem Zusammenbruch verschiedener Brennstoffe abgeleiteter Energie in die bioenergetische Währung der Zelle ATP. Das ETC besteht aus 5 massiven Proteinkomplexen, die sich auch in Supercomplexe mit dem Namen respirasomes (CI, C-III und C-IV) und Synthasomen (CV) zusammensetzen, die die Effizienz des Elektronentransports und der ATP-Produktion erhöhen. Seit über 50 Jahren werden verschiedene Methoden zur ETC-Funktion eingesetzt, aber diese Protokolle geben keine Informationen über die Montage von einzelnen Komplexen und Supercomplexen. Dieses Protokoll beschreibt die Technik der nativen Gel-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), ein Verfahren, das vor mehr als 20 Jahren modifiziert wurde, um die ETC-Komplexstruktur zu untersuchen. Die native Elektrophorese erlaubt die Trennung von ETC-Komplexen in ihre aktiven Formen, und diese Komplexe können dann unter Verwendung von Immunoblotting, In-Gel-Assays (IGA) und Reinigung durch Elektroelution untersucht werden. Durch die Kombination der ReSorten der nativen Gel-PAGE mit denen anderer mitochondrialer Assays ist es möglich, ein komplettes Bild der ETC-Aktivität, ihrer dynamischen Assemblierung und Demontage zu erhalten und wie dies die mitochondriale Struktur und Funktion reguliert. Diese Arbeit wird auch Beschränkungen dieser Techniken diskutieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Technik der nativen PAGE, gefolgt von Immunoblotting, IGA und Elektroelution, die nachstehend dargestellt ist, eine leistungsfähige Möglichkeit ist, die Funktionalität und Zusammensetzung von mitochondrialen ETC-Supercomplexen zu untersuchen.
Introduction
Mitochondriale Energie in Form von ATP ist nicht nur essentiell für das Zellüberleben, sondern auch für die Regulation des Zelltods. Die Erzeugung von ATP durch oxidative Phosphorylierung erfordert eine funktionelle Elektronentransportkette (ETC, Cx-I bis IV) und mitochondriale ATP-Synthase (Cx-V). Jüngste Studien haben gezeigt, dass diese großen Proteinkomplexe zu Superkomplexen, sogenannten respirasomen und Synthasomen 1 , 2 , organisiert sind . Es ist anspruchsvoll, die Montage-, Dynamik- und Aktivitätsregulierung dieser massiven Komplexe und Superkomplexe zu analysieren. Während Sauerstoffverbrauchsmessungen, die mit einer Sauerstoffelektrode durchgeführt wurden, und Enzymtests, die unter Verwendung eines Spektrophotometers durchgeführt wurden, wertvolle Informationen über die ETC-Komplexaktivität liefern können, können diese Assays keine Information über die Anwesenheit, die Größe und die Untereinheitszusammensetzung des Proteinkomplexes oder der betroffenen Superkomplexe liefern. Allerdings ist die Entwicklung von blau und klar native (BN und CN) SEITE 3 hat ein leistungsfähiges Werkzeug geschaffen, um wichtige Informationen über komplexe Komposition und Montage / Demontage und über die dynamische Regulierung der supramolekularen Organisation dieser lebenswichtigen Atmungskomplexe unter physiologischen und pathologischen Zuständen aufzudecken.
Die Zusammenstellung dieser Komplexe in übergeordnete Superkomplexe scheint die mitochondriale Struktur und Funktion 5 zu regulieren. Beispielsweise erhöht die respirasome Anordnung den Wirkungsgrad des Elektronentransfers und die Erzeugung der Protonenmotivkraft über die mitochondriale innere Membran 5 . Darüber hinaus erhöht die Zusammenstellung von Synthasomen nicht nur die Effizienz der ATP-Produktion und die Übertragung von Energieäquivalenten in das Zytoplasma 2 , sondern auch die mitochondriale innere Membran in die tubuläre Cristae 6 , </ Sup> 7 Untersuchungen der superkomplexen Assemblierung bei der Herzentwicklung bei Mausembryonen zeigen, dass die Erzeugung von Cx-I-haltigen Supercomplexen im Herzen bei etwa embryonalen Tag 13,5 8 beginnt. Andere haben gezeigt, dass die Menge an Cx-I-haltigen Superkomplexen im Herzen aufgrund von Alterung oder Ischämie / Reperfusionsverletzungen 9 , 10 abnimmt oder eine Rolle bei der Progression neurodegenerativer Erkrankungen spielen kann 11 .
Dieses Protokoll beschreibt Methoden für native Gel-PAGE, die verwendet werden können, um die Zusammenstellung und Aktivität der ETC-Komplexe und Superkomplexe zu untersuchen. Das ungefähre Molekulargewicht von mitochondrialen Superkomplexen kann durch Trennen der Proteinkomplexe in CN- oder BN-Polyacrylamidgelen bestimmt werden. CN-PAGE ermöglicht auch die Visualisierung der enzymatischen Aktivität aller mitochondrialen Komplexe direkt im Gel (In-Gel-Assays;IGA) 12 . Diese Arbeit zeigt die Aktivität von respirasomen, indem sie die Fähigkeit von Cx-I, NADH durch IGA zu oxidieren, und die Anwesenheit von Synthasomen aufgrund der ATP-hydrolysierenden Aktivität von Cx-V durch IGA hervorhebt. Die Mehrfachkomplexe und die Cx-I und Cx-V enthaltenden Komplexe können auch durch Übertragung der Proteine auf Nitrozellulosemembranen und Durchführen von Immunoblotting nachgewiesen werden. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass BN oder CN PAGE im Allgemeinen Proteinkomplexe auf der Grundlage ihrer physiologischen Größe und Zusammensetzung trennt; Der Transfer zu einer Membran bewahrt dieses Muster von Bändern. Die Analyse von Proteinkomplexen in einer BN- oder CN-PAGE kann auch mit 2D-PAGE durchgeführt werden (siehe Fiala et al., 13 für eine Demonstration) oder durch Saccharose-Dichte-Zentrifugation 14 , 15 . Um ein bestimmtes Band weiter zu analysieren, kann es aus der BN PAGE herausgeschnitten werden, und die Proteine aus diesem Proteinkomplex können gereinigt werdenD durch elektrolytieren sie unter nativen Bedingungen. Eine native Elektroelution kann innerhalb von wenigen Stunden durchgeführt werden, was einen signifikanten Unterschied zur passiven Diffusion (wie in Referenz 16 verwendet) von Proteinen aus einem Gel in den umgebenden Puffer machen könnte.
Zusammenfassend beschreiben diese Methoden mehrere Ansätze, die die weitere Charakterisierung von hochmolekularen Superkomplexen aus mitochondrialen Membranen ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die mitochondriale ATP-Erzeugung ist ein funktionelles ETC erforderlich. Die Komplexe des ETC sind in der Lage, zwei Arten von Supercomplexen zu bilden: die respirasomen (Cx-I, -III und -IV) 1 und die Synthasomen (Cx-V) 2 . Die Montage jedes Komplexes ist für eine intakte ETC erforderlich, während die Organisation des ETC in Supercomplexe die Gesamt-ETC-Effizienz 5 , 22 erhöhen soll. Wie diese Supercomplexe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] und der Starken Kinder-Forschungszentrum an der University of Rochester.
Materials
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCL | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
References
- Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
- Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
- Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
- Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
- Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
- Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
- Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
- Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
- Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
- Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
- Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
- Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
- Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).
