Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi
Summary
Bu protokol, fonksiyonel mitokondriyal elektron transport zincir komplekslerinin (Cx) IV ve bunların süper komplekslerinin yerli elektroforezi kullanarak, bunların montajı ve yapısı hakkında bilgi vermek üzere ayrılmasını açıklamaktadır. Nativ jel immünoblotlama, in-jel deneylerine tabi tutulabilir ve bireysel kompleksleri daha da karakterize etmek için elektroliz ile saflaştırılabilir.
Abstract
Mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC), çeşitli yakıtların parçalanmasından elde edilen enerjiyi hücre ATP'nin biyoenerjetik para birimine dönüştürür. ETC, elektron taşıma ve ATP üretiminin verimliliğini arttıran respirasom (CI, C-III ve C-IV) ve synthasomes (CV) süper komplekslerine de dahil olan 5 büyük protein kompleksinden oluşur. ETC fonksiyonunu ölçmek için 50 yılı aşkın süredir çeşitli yöntemler kullanılmıştır, ancak bu protokoller bireysel komplekslerin ve süper komplekslerin montajı hakkında bilgi sağlamamaktadır. Bu protokol, yerli jel poliakrilamid jel elektroforezinin (PAGE), ETC karmaşık yapısını incelemek için 20 yıldan daha önce modifiye edilmiş bir yöntemi açıklar. Doğal elektroforez, ETC komplekslerinin aktif formlarına ayrılmasına izin verir ve bu kompleksler daha sonra immünoblotlama, jel içi deneyler (IGA) ve elektroliz ile saflaştırma kullanılarak incelenebilir. BirleştirerekDoğal jel PAGE'in diğer mitokondriyal deneylerle elde edildiği durumlarda, ETC aktivitesinin kompleman resmini, dinamik birleştirme ve demonte parçasını ve bunun mitokondriyal yapı ve işlevi nasıl düzenlediğini görmek mümkündür. Bu çalışma aynı zamanda bu tekniklerle ilgili sınırlamaları tartışacaktır. Özetle, aşağıda sunulan immünoblotlama, IGA ve elektroelüsyon takip eden yerli PAGE tekniği mitokondrial ETC süper komplekslerinin işlevselliğini ve kompozisyonunu araştırmanın güçlü bir yoludur.
Introduction
ATP formundaki mitokondrial enerji, sadece hücre sağkalımı için değil, aynı zamanda hücre ölümünün düzenlenmesi için de gereklidir. Oksidatif fosforilasyon ile ATP'nin üretilmesi, fonksiyonel bir elektron taşıma zinciri (ETC; Cx-I ila IV) ve mitokondriyal ATP sentaz (Cx-V) gerektirir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, bu büyük protein komplekslerinin respirazomlar ve synthasomes 1 , 2 olarak adlandırılan süper kompleksler halinde düzenlendiğini göstermiştir. Bu muazzam komplekslerin ve süper komplekslerin montajını, dinamiklerini ve faaliyet düzenlemelerini analiz etmek zor. Bir oksijen elektrodu ile alınan oksijen tüketimi ölçümleri ve bir spektrofotometre kullanılarak gerçekleştirilen enzim analizleri, ETC karmaşık aktivitesi hakkında değerli bilgiler verebilirken, bu testler, ilgili protein kompleksinin veya süper komplekslerin varlığı, boyutu ve alt birimi kompozisyonu hakkında bilgi sağlayamaz. Bununla birlikte, mavi ve berrak yerli (BN ve CN) SAYFA 3 , fizyolojik ve patolojik koşullar altında karmaşık kompozisyon, montaj / demontaj ve bu hayati solunum komplekslerinin supramoleküler organizasyonunun dinamik düzenlenmesi hakkında önemli bilgileri açığa çıkarmak için güçlü bir araç yarattı.
Bu komplekslerin yüksek mertebeli süper komplekslere birleştirilmesi, mitokondriyal yapıyı ve fonksiyonu düzenler gibi gözükmektedir 5 . Örneğin respirasome düzeneği, elektron transferinin verimliliğini ve mitokondriyal iç zar 5 boyunca proton güdü kuvvetinin oluşmasını arttırır. Buna ek olarak, sentazomların bir araya getirilmesi sadece ATP üretiminin etkinliğini ve enerji eşdeğerlerinin sitoplazma 2'ye aktarılmasını arttırmakla kalmaz, aynı zamanda mitokondriyal iç zar da boru şekilli cristae 6'ya kalıplar./ Sup> 7 . Fare embriyolarında kardiyak gelişim sırasında süper kompleks birleştirme çalışmaları, kalpteki Cx-I içeren süper kompleks oluşumunun yaklaşık embriyonik gün 13.5 8'de başladığını göstermektedir. Bazıları, yaşlanma veya iskemi / reperfüzyon yaralanmaları 9 , 10 nedeniyle kalpte Cx-I içeren süper kompleks miktarının azaldığını veya nörodejeneratif hastalıkların ilerlemesinde rol oynayabileceğini göstermiştir.
Bu protokol, ETC kompleksleri ve süper komplekslerinin toplanması ve aktivitesini araştırmak için kullanılabilen yerli jel PAGE için yöntemleri açıklamaktadır. Mitokondriyal süper komplekslerin yaklaşık molekül ağırlığı, protein komplekslerinin CN veya BN poliakrilamid jeller ile ayrılmasıyla değerlendirilebilir. CN PAGE ayrıca tüm mitokondriyal komplekslerin enzimatik aktivitesinin jel içinde doğrudan görselleştirilmesini sağlar (in-jel deneyleri;IGA) 12 . Bu çalışma, CX-I'in IGA yoluyla NADH'yi oksitleme kabiliyetini ve IXA tarafından Cx-V'nin ATP-hidrolize edici aktivitesine bağlı olarak sentazomların varlığını vurgulayarak respirasomların aktivitesini gösterir. Cx-I ve Cx-V içeren çoklu kompleksler ve süper kompleksler, proteinlerin nitroselüloz membranlara aktarılması ve imünoblotlama yapılması ile de gösterilebilir. Bu yaklaşımın avantajı, BN veya CN PAGE'nin genellikle protein komplekslerini fizyolojik büyüklükleri ve bileşimine göre ayırmasıdır; Bir membrana transfer bu bant modelini korur. Bir BN veya CN PAGE'deki protein komplekslerinin analizi, 2D-PAGE (bir gösteri için bkz. Fiala ve diğerleri 13 ) veya sakkaroz yoğunluğu santrifüjleme 14 , 15 ile de yapılabilir. Belirli bir bandı daha ayrıntılı olarak analiz etmek için, BN PAGE'den çıkarılabilir ve bu protein kompleksinden alınan proteinler saflaştırılabilirD onları doğal koşullar altında elektro-eriterek. Doğal elektroelüsyon, birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir, bu da bir jelden proteinlerin çevresindeki tampona pasif difüzyona (Referans 16'da kullanıldığı gibi) önemli bir fark yaratabilir.
Özetle, bu yöntemler, yüksek molekül ağırlıklı süper komplekslerin mitokondriyal membranlardan daha fazla karakterize edilmesini sağlayan birkaç yaklaşımı açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondriyal ATP üretimi için fonksiyonel bir ETC gerekir. ETC kompleksleri, iki tip süper kompleks oluşturabilirler: respirazomlar (Cx-I, -III ve -IV) 1 ve synthasomes (Cx-V) 2 . ETC'nin süper kompleksler halinde düzenlenmesinin, toplam ETC verimliliğini arttırdığı düşünülürken, her bir kompleksin sağlam bir ETC için bir araya getirilmesi gerekiyor 5,22. Bu süper komplekslerin nasıl bir araya gelip parçalarına ayrıldığı iyi anlaşılmamışt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Kurucu Ortaklığı [12GRNT12060233] ve Rochester Üniversitesi'ndeki Güçlü Çocuk Araştırma Merkezi'nden hibeler tarafından desteklendi.
Materials
| Protean II mini-gel chamber | Biorad | 1658004 | Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis |
| Protean XL maxi-gel | Biorad | 1653189 | Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis |
| Gradient maker, Hoefer SG15 | VWR | 95044-704 | Pouring mini-gel gradients |
| Gradient maker, maxi-gel | VWR | GM-100 | Pouring maxi-gel gradients |
| Transfer kit | Biorad | 1703930 | Complete set to wet transfer of proteins onto membranes |
| Electroeluter model 422 | Biorad | 1652976 | Electroelution of proteins from native or SDS PAGES |
| Glass plates | Biorad | 1653308 | Short plates |
| Glass plates | Biorad | 1653312 | Spacer plates |
| Glass plates | Biorad | 1651823 | Inner plates |
| Glass plates | Biorad | 1651824 | Outer Plates |
| Power supply | Biorad | 1645070 | Power supply suitable for native electrophoresis |
| ECL-Western | Thermo Scientific | 32209 | Chemolumniscense substrate |
| SuperSignal-West Dura | Thermo Scientific | 34075 | Enhanced chemolumniscense substrate |
| Film/autoradiography film | GE Health care | 28906845 | Documentation of Western blots |
| Film processor CP1000 | Agfa | NC0872640 | |
| Canon Power Shot 640 | Canon | NA | Taking photos to document gels, membranes and blots. |
| Canon Power Shot 640 Camera hood | Canon | shielding camera for photos being taken on a light table | |
| Acrylamide/bisacrylamide | Biorad | 1610148 | 40% pre-mixed solution |
| Glycine | Sigma | G7403 | |
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | Invitrogen | 15525-017 | |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Buffer |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Sodium deoxychelate | Sigma | D66750 | Detergent |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | Buffer |
| Imidazole | Sigma | I15513 | Buffer |
| Lauryl maltoside | Sigma | D4641 | Detergent |
| Coomassie G250 | Biorad | 161-0406 | |
| Aminohexanoic acid | Sigma | O7260 | |
| Native molecular weight kit | GE Health care | 17-0445-01 | High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NADH | Sigma | N4505 | |
| Nitroblue tetrazolium | Sigma | N6639 | |
| Tris HCL | Sigma | T3253 | |
| ATP | Sigma | A2383 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): | Sigma | 228621 | |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| anti-ATP5A | Abcam | ab14748 | antibody to ATP synthase subunit ATP5A |
| anti-NDUFB6 | Abcam | ab110244 | antibody to Cx-1 subunit NDUFB6 |
| anti-VDAC | Calbiochem | 529534 | antibody to VDAC |
| ECL HRP linked antibody | GE Health Care | NA931V | secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC |
| Blocking reagent | Biorad | 170-6404 | |
| BSA | |||
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silver staining Kit | Invitrogen | LC6070 |
References
- Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
- Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
- Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
- Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
- Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
- Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
- Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
- Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
- Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
- Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
- Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
- Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
- Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
- Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
- Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
- Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
- Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
- Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
- Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
- Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
- Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
- Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).
