Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

Summary

Este trabalho descreve um protocolo optimizado de sequenciação de domínio de ligação de metil-CpG (MBD) e uma tubagem computacional para identificar regiões ricas em CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL).

Abstract

O papel de ARNs não codificados longos (lncRNAs) em câncer está chegando à vanguarda devido ao crescente interesse em entender suas funções mecanicistas durante o desenvolvimento e progressão do câncer. Apesar disso, a regulação epigenética global dos ARNnc e as seqüências repetitivas no câncer não foi bem investigada, particularmente na leucemia linfocítica crônica (CLL). Este estudo centra-se em uma abordagem única: a captação baseada em imunoprecipitação de fragmentos de DNA metilados de cadeia dupla usando proteínas de domínio de ligação a metilo (MBD), seguido de sequenciação de próxima geração (MBD-seq). As amostras de pacientes CLL pertencentes a dois subgrupos prognósticos (5 amostras mutadas de IGVH + 5 amostras não mutadas IGVH) foram utilizadas neste estudo. A análise revelou 5.800 hipermetilados e 12.570 genes metilados diferencialmente específicos de CLL específicos de CLL (cllDMGs) em comparação com controles saudáveis ​​normais. Importante, esses resultados identificaram vários ARNnc específicos de CLL, diferencialmente metilados, reElementos petitivos e genes codificadores de proteínas com potencial valor prognóstico. Este trabalho descreve um protocolo detalhado para um pipeline MBD-seq e bioinformática desenvolvido para a análise abrangente de perfis globais de metilação em regiões altamente ricas em CpG usando amostras de pacientes CLL. Finalmente, um gene codificador de proteína e um ARNnc foram validados usando pirosequenciamento, que é um método altamente quantitativo para analisar os níveis de metilação CpG para corroborar ainda mais os achados do protocolo MBD-seq.

Introduction

O uso de técnicas de sequenciação da próxima geração para analisar os perfis globais de metilação do DNA tem sido cada vez mais popular nos últimos anos. Os ensaios de metilação em todo o genoma, incluindo métodos baseados em microarray e não microarray, foram desenvolvidos com base no seguinte: conversão de bisulfito de DNA genômico, digestão de enzimas de restrição sensíveis à metilação e imunoprecipitação de DNA metilado usando anticorpos específicos de CpG de metilo .

A metilação aberrante do DNA é uma das características da leucemia e linfomas, incluindo a leucemia linfocítica crónica (CLL). Anteriormente, vários grupos, incluindo o nosso, caracterizaram os perfis de metilação do DNA de diferentes subgrupos prognósticos de CLL e controles de células B normais e saudáveis ​​usando a conversão de bisulfito de DNA genômico, seguidos de métodos baseados em micro-matriz ou seqüenciamento de todo o genoma ^{1 , 2 , 3} <Sup class = "xref"> 4. A conversão de bisulfito de DNA genômico leva à desaminação de citosinas não modificadas para uracilo, deixando as citosinas metiladas modificadas no genoma. Uma vez convertido, o estado de metilação do DNA pode ser determinado por amplificação e sequenciação de PCR usando diferentes métodos quantitativos ou qualitativos, como a seqüenciamento de bisulfito de microorganismos ou todo o genoma (WGBS). Embora os métodos baseados em conversão de bisulfito tenham muitas vantagens e sejam amplamente utilizados em diferentes tipos de câncer para analisar os níveis de metilação do DNA, existem algumas desvantagens associadas a esta técnica. O seqüenciamento do WGBS permite a resolução de pares de bases únicas com menores quantidades de DNA e é a melhor opção para analisar um grande número de amostras. No entanto, este método não diferencia as modificações entre os níveis de 5 mC e 5 hmC no genoma ^{5 , 6} . Além disso, os métodos baseados em microarray não oferecem completo cSuperação do genoma.

Em um estudo recente de nosso laboratório ⁷ , os métodos baseados em imunoprecipitação, em vez de conversão de bisulfito, foram utilizados para identificar regiões altamente diferenciadas e diferenciadas de CpG em escala global em pacientes com CLL e controles saudáveis ​​normais. Secerto de próxima geração de domínio de ligação de inmetil-CpG (MBD) (MBD-seq), o enriquecimento de DNA fragmentado de cadeia dupla depende do grau de metilação de CpG. Este método pode superar as desvantagens do método de conversão de bisulfito e também pode proporcionar cobertura genômica de metilação de CpG de maneira independente e independente de PCR. Além disso, ao contrário dos métodos de microarray baseados em conversão de bisulfito, MBD-seq pode ser usado para analisar o estado de metilação de elementos repetitivos, como longos elementos nucleares intercalados (LINEs), elementos nucleares intercalados curtos (SINEs), repetições terminais longas (LTRS) Etc. No entanto, em comparação com os métodos de conversão de bisulfito,Um protocolo MBD-seq requer uma quantidade relativamente grande de DNA de entrada. Além disso, a qualidade das leituras de seqüências e os dados dependem da especificidade, afinidade e qualidade dos anticorpos utilizados.

O presente estudo explica um protocolo MBD-seq detalhado para enriquecer DNA metilado para sequenciação da próxima geração. Ele usa um kit comercial de enriquecimento de ligação de DNA metilado (listado na Tabela de Materiais ), bem como uma tubulação computacional para visualizar e interpretar dados de seqüenciamento de metilação para identificar regiões hiper e hipometiladas específicas de CLL em comparação com controles saudáveis ​​normais. Basicamente, este método faz uso da capacidade do MBD da interação da proteína MBD2 humana com CpGs metilados para extrair DNA enriquecido com CpGs metilados, e isso é seguido pelo seqüenciamento de alto rendimento do DNA metilado.

Protocol

A aprovação ética para coletar as amostras CLL é de 2007-05-21, com o seguinte número de registro: EPN Gbg dnr 239/07. Todos os pacientes com CLL foram diagnosticados de acordo com os critérios recentemente revisados 8 , e as amostras foram coletadas no momento do diagnóstico. Os pacientes do estudo foram incluídos em diferentes departamentos de hematologia na parte ocidental da Suécia, após o consentimento por escrito ter sido obtido. Somente amostras de células mononucleares de sangu…

Representative Results

O MBD-seq foi recentemente realizado em pacientes com CLL e controles compatíveis, normais e saudáveis ​​para identificar genes especificamente hiper e hipometilados CLL específicos 7 . O pipeline experimental e bioinformático utilizado para analisar os dados gerados a partir de CLL e amostras saudáveis ​​normais são mostrados na Figura 1A e 1B . Essas análises identificaram várias regiões diferencial…

Discussion

O MBD-seq é uma técnica baseada em imunoprecipitação baseada em custos, que pode ser usada para estudar padrões de metilação com cobertura completa do genoma. Ambos MeDIP seq (imunoprecipitação de DNA metilado seguido de seqüenciamento) e MBD-seq resultam no enriquecimento de DNA metilado rico em CpG. No entanto, MBD-seq mostra mais afinidade para a ligação a regiões altamente ricas em CpG quando comparadas com MeDIP seq ¹⁹ . Usando um kit de enriquecimento de ligação de metilo, po…

Materials

Dneasy Blood and tissue kit	Qaigen	69504
Lymphoprep solution	A X I S-S H I E L D	1114544
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE buffer PH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor standard sonication device	Diagenode	UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5ml	Diagenode	C30010010-300
3 M Sodium acetate	Diagenode	C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2% Agarose gels	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Vortex mixer	VWR	12620-848
Absolute Ethanol	Any company
70% Ethanool	Any company
DNAse free water	Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate)	Diagenode	C03030002
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0.5ml tubes	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform	Illumina
Water  Bath	Grant
Heat block	grant
Tube rotater	Labquake