Análisis de metilación de ADN completo usando un método de captura de dominio de unión a metil-CpG en pacientes con leucemia linfocítica crónica

Summary

Este trabajo describe un optimizado metil-CpG vinculante dominio de secuenciación de protocolo y una tubería computacional para identificar diferencial metilado CpG-ricos en regiones crónicas linfocítica leucemia (CLL) pacientes.

Abstract

El papel de los ARNs no codificantes largos (lncRNAs) en el cáncer está llegando a la vanguardia debido al interés creciente en la comprensión de sus funciones mecánicas durante el desarrollo y la progresión del cáncer. A pesar de ello, la regulación epigenética global de lncRNAs y secuencias repetitivas en el cáncer no ha sido bien investigado, en particular en la leucemia linfocítica crónica (CLL). Este estudio se centra en un enfoque único: la inmunoprecipitación de captura de doble hundidos, metilado ADN fragmentos utilizando metil-binding domain (MBD) proteínas, seguido por la próxima generación de secuenciación (MBD-seq). CLL muestras de pacientes pertenecientes a dos subgrupos de pronóstico (5 IGVH mutado muestras + 5 IGVH unmutated muestras) se utilizaron en este estudio. El análisis reveló 5.800 genes hipermetilados y 12.570 hipometilados CLL específicos diferencialmente metilados (cllDMGs) en comparación con los controles sanos normales. Es importante destacar que estos resultados identificaron varios LncRNA específicos CLL, diferencialmente metilados, reY los genes codificadores de proteínas con un posible valor pronóstico. Este trabajo esboza un protocolo detallado para un MBD seq y bioinformática pipeline desarrollado para el análisis exhaustivo de la metilación global perfiles en altamente CpG regiones ricas utilizando CLL muestras de pacientes. Por último, un gen de codificación de proteínas y un lncRNA fueron validados mediante pirosequencing, que es un método altamente cuantitativo para analizar los niveles de metilación CpG para corroborar aún más los hallazgos del protocolo MBD-seq.

Introduction

El uso de técnicas de secuenciación de próxima generación para analizar los perfiles globales de metilación del ADN ha sido cada vez más popular en los últimos años. Se desarrollaron ensayos de metilación en todo el genoma, incluyendo métodos basados ​​en microarrays y no microarrays, basados ​​en lo siguiente: la conversión de bisulfito de ADN genómico, digesiones de enzimas de restricción sensibles a la metilación y la inmunoprecipitación de ADN metilado usando anticuerpos específicos de metil CpG .

La metilación aberrante del ADN es una de las características de la leucemia y de los linfomas, incluida la leucemia linfocítica crónica (CLL). Anteriormente, varios grupos, incluidos los nuestros, caracterizaron los perfiles de metilación del ADN de diferentes subgrupos de pronóstico CLL y controles de células B normales y sanos utilizando la conversión de bisulfito de ADN genómico, seguido de métodos basados ​​en micro-matriz o secuenciación de todo el genoma ^{1 , 2 , 3 ,} <Sup class = "xref"> 4. La conversión de bisulfito de ADN genómico conduce a la desaminación de citosinas no modificadas a uracilo, dejando las citosinas metiladas modificadas en el genoma. Una vez convertido, el estado de metilación del ADN puede determinarse mediante amplificación y secuenciación por PCR utilizando diferentes métodos cuantitativos o cualitativos, tales como la secuenciación de bisulfito de todo el genoma o de micro-matriz o WGBS. Aunque los métodos basados ​​en conversión de bisulfito tienen muchas ventajas y se usan ampliamente en diferentes tipos de cáncer para analizar los niveles de metilación del ADN, hay algunos inconvenientes asociados con esta técnica. La secuenciación WGBS permite una resolución de un par de bases con menores cantidades de ADN y es la mejor opción para analizar un gran número de muestras. Sin embargo, este método no logra diferenciar las modificaciones entre los niveles de 5 mC y 5 hmC en el genoma ^{5 , 6} . Además, los métodos basados ​​en microarrays no ofrecen completas cExceso del genoma.

En un estudio reciente de nuestro laboratorio ⁷ , los métodos basados ​​en la inmunoprecipitación, en lugar de la conversión de bisulfito, se utilizaron para identificar regiones altamente metiladas, ricas en CpG, a escala global en pacientes con CLL y controles sanos normales. Inmetil-CpG-dominio de unión (MBD) de próxima generación de secuenciación (MBD-seq), el enriquecimiento de doble hilado de ADN fragmentado depende del grado de metilación CpG. Este método puede superar los inconvenientes del método de conversión de bisulfito y también puede proporcionar cobertura genómica de la metilación de CpG de una manera imparcial y independiente de la PCR. Además, a diferencia de los métodos de microarrays basados ​​en conversión de bisulfito, MBD-seq se puede utilizar para analizar el estado de metilación de elementos repetitivos, tales como elementos nucleares intercalados largos (LINEs), elementos nucleares intercalados cortos (SINEs), repeticiones terminales largas (LTRS) Etc. Sin embargo, en comparación con los métodos de conversión de bisulfito,Un protocolo MBD-seq requiere una cantidad relativamente grande de ADN de entrada. Además, la calidad de las lecturas de secuenciación y los datos dependen de la especificidad, afinidad y calidad de los anticuerpos utilizados.

El presente estudio explica un detallado MBD-seq protocolo para enriquecer el ADN metilado para la próxima generación de secuenciación. Utiliza un kit comercial de enriquecimiento de ADN metilado (listado en la Tabla de Materiales ), así como un oleoducto computacional para visualizar e interpretar los datos de secuenciación de metilación para identificar regiones hiper y hipometiladas específicas de CLL en comparación con los controles sanos normales. Básicamente, este método hace uso de la capacidad de la MBD de la interacción de la proteína MBD2 humana con CpGs metiladas para extraer el ADN enriquecido con CpGs metiladas, y esto es seguido por la secuenciación de alto rendimiento del ADN metilado.

Protocol

La aprobación ética para la recolección de muestras CLL es del 2007-05-21, con el siguiente número de registro: EPN Gbg dnr 239/07. Todos los pacientes con CLL fueron diagnosticados de acuerdo con criterios recientemente revisados 8 , y las muestras fueron recolectadas en el momento del diagnóstico. Los pacientes en el estudio se incluyeron de diferentes departamentos de hematología en la parte occidental de Suecia, después de haber obtenido el consentimiento por escrito. Sólo se seleccio…

Representative Results

MBD-seq se realizó recientemente en CLL pacientes y controles igualados, normales, sanos para identificar CLL específicos hipertensos y hypomethylated genes [ 7] . La tubería experimental y bioinformática utilizados para analizar los datos generados a partir de CLL y muestras sanas normales se muestran en la Figura 1A y 1B . Estos análisis identificaron varias regiones diferenciadamente metiladas CLL-específicas…

Discussion

MBD-seq es una técnica rentable basada en inmunoprecipitación que se puede utilizar para estudiar los patrones de metilación con una cobertura completa del genoma. Tanto MeDIP seq (inmunoprecipitación de ADN metilado seguido de secuenciación) como MBD-seq resultan en el enriquecimiento de ADN metilado rico en CpG. Sin embargo, MBD-seq muestra más afinidad hacia la unión a regiones altamente ricas en CpG cuando se compara con MeDIP seq ¹⁹ . Usando un kit de enriquecimiento de unión a metil…

Materials

Dneasy Blood and tissue kit	Qaigen	69504
Lymphoprep solution	A X I S-S H I E L D	1114544
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE buffer PH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor standard sonication device	Diagenode	UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5ml	Diagenode	C30010010-300
3 M Sodium acetate	Diagenode	C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-gel 2% Agarose gels	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Vortex mixer	VWR	12620-848
Absolute Ethanol	Any company
70% Ethanool	Any company
DNAse free water	Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate)	Diagenode	C03030002
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0.5ml tubes	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform	Illumina
Water  Bath	Grant
Heat block	grant
Tube rotater	Labquake