Métodos para la extracción de endosimbiontes de la mosca blanca<em> Bemisia tabaci</em
Summary
En este sentido, se presenta un protocolo para aislar endosimbiontes de la mosca blanca Bemisia tabaci a través de la disección y la filtración. Después de la amplificación, las muestras de ADN son adecuadas para la posterior secuenciación y estudio del mutualismo entre los endosimbiontes y la mosca blanca.
Abstract
Los simbiontes bacterianos forman una relación íntima con sus huéspedes y otorgan ventajas a los huéspedes en la mayoría de los casos. La información genómica es fundamental para estudiar las funciones y la evolución de los simbiontes bacterianos en su huésped. Como la mayoría de los simbiontes no pueden cultivarse in vitro , los métodos para aislar una cantidad adecuada de bacterias para la secuenciación del genoma son muy importantes. En la mosca blanca Bemisia tabaci , se ha identificado una serie de endosimbiontes y se prevé que sean importantes en el desarrollo y la reproducción de las plagas mediante múltiples enfoques. Sin embargo, el mecanismo que sustenta a las asociaciones sigue siendo en gran parte desconocido. El obstáculo proviene parcialmente del hecho de que los endosimbiontes en la mosca blanca, en su mayoría restringidos en bacteriocitos, son difíciles de separar de las células huésped. Aquí presentamos un protocolo paso a paso para la identificación, extracción y purificación de endosimbiontes de la mosca blanca B. tabaci principalmente por disectiY filtración. Las muestras de endosymbiont preparadas por este método, aunque todavía son una mezcla de diferentes especies endosymbiont, son adecuadas para secuenciación subsecuente del genoma y análisis de las posibles funciones de los endosimbiontes en B. tabaci . Este método también puede usarse para aislar endosimbiontes de otros insectos.
Introduction
Las bacterias que forman una relación simbiótica íntima con huéspedes relativos están muy extendidas en los artrópodos 1 . Se ha demostrado que los endosimbiontes afectan aspectos de los huéspedes, como el metabolismo nutricional, la reproducción, las respuestas a las tensiones ambientales 2 , 3 , 4 , etc. , en casi todas las etapas del desarrollo 5 . Sin embargo, el mecanismo que sustenta a las asociaciones sigue siendo en gran parte desconocido. La genómica es de prioridad e importancia al estudiar las posibles funciones y funciones de las bacterias. Algunos datos fundamentales, es decir , el estado taxonómico, los genes funcionales, las vías del metabolismo, los sistemas de secreción, se puede inferir a partir de las secuencias del genoma, que arroja luces sobre el papel potencial de los simbiontes en la simbiosis. Con el desarrollo de secuenciación de alto rendimiento, un gran número de genomas bacterianos han sido secuenciados wCon diversas funciones reveladas 6 .
Los endosimbiontes son de vital importancia en los hemípteros, como los áfidos 7 , las chinches 8 , los psílidos 9 , los saltamontes marrones 10 y las cigarras 11 . Por ejemplo, se ha demostrado que Buchnera en áfidos, como el simbionte obligado, está implicado en la biosíntesis de aminoácidos esenciales, junto con los genes del genoma de áfidos 12 . Además, la regulación transcripcional de Buchnera también se revela [ 13] . En los psílidos , Carsonella es secuenciado y clasificado como el genoma bacteriano más pequeño jamás encontrado 14 . Todas estas características de endosymbionts se basan e inferir a partir de las secuencias del genoma. Debido a que estos endosimbiontes no pueden cultivarse in vitro , se han aplicado varios métodos para aislar bacterias adecuadas para seqCión. En los áfidos, endosymbionts se extraen a través de la centrifugación y la filtración, y sometidos a más genómica y transcriptomic análisis [ 5] . En los saltamontes marrones, los endosimbiontes se secuencian junto con el genoma del insecto 10 .
Whitefly B. tabaci es un complejo de especies que contiene más de 35 especies morfológicamente indistinguibles (especies crípticas), entre las cuales, dos especies invasoras han invadido todo el mundo y causado un daño tremendo a la producción agrícola 15 . De nota, endosimbiontes dentro de la especie B. tabaci han demostrado importancia en el desarrollo de las plagas [ 16] . Hasta la fecha, se han identificado ocho endosimbiontes en la mosca blanca, incluyendo el simbionte obligado, Candidatus Portiera aleyrodidarum y siete simbiontes secundarios Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,Em> Wolbachia, Fritschea y Hemipteriphilus definidos 17 , 18 .
A diferencia de los hemípteros descritos anteriormente, la mosca blanca B. tabaci es un insecto extremadamente pequeño de sólo 1 mm de longitud. La mayoría de los endosimbiontes están confinados a bacteriocitos 19 (células especializadas que contienen simbiontes, que forman bacteriomas en B. tabaci ). Además, estos endosimbiontes no pueden cultivarse in vitro . La única forma de obtener endosimbiontes de B. tabaci es diseccionar la bacterioma. Sin embargo, hay dificultad en la disección. En primer lugar, el bacterioma frágil siempre se vincula con otros tejidos de la mosca blanca, que es difícil de separar. En segundo lugar, el pequeño tamaño de la mosca blanca limita el aislamiento de bacteriomas suficientes. En tercer lugar, endosymbionts cluster en la bacterioma, por lo que es extremadamente complicado para adquirir una sola especie de bacteria.
<p clasfa = "jove_content"> Aquí, informamos de un protocolo simple y barato para aislar whitefly endosymbionts para subsiguiente secuenciación metagenome. A través de la disección, la purificación y la amplificación, se pudo obtener ADN endosimbionto adecuado y se pudo confirmar la especie de bacteria. El protocolo descrito se puede utilizar de manera similar en otros artrópodos.Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo financiero para este estudio fue proporcionado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave (2016YFC1200601) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31390421).
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
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