رصد إير / سر إطلاق الكالسيوم مع الكالسيوم المستهدفة<sup> 2+</sup> الاستشعار الماسك<sup> +</sup
Summary
نقدم البروتوكولات لتطبيق لدينا الهدف الكنسي المشفرة وراثيا مؤشر (جيسي) الماسك + لرصد العابرين الكالسيوم السريع في الشبكة الداخلية / ساركوبلاسميك (إير / سر) من HEK293 والهيكل العظمي خلايا C2C12 العضلات باستخدام في الوقت الحقيقي المجهر مضان. ويناقش أيضا بروتوكول للقياس في الموقع K د ومعايرة.
Abstract
الكالسيوم داخل الخلايا (كا 2 + ) العابرين التي أثارها المحفزات خارج الخلية الشروع في العديد من العمليات البيولوجية في الكائنات الحية. في مركز الإفراج عن الكالسيوم داخل الخلايا هي العضيات الرئيسية تخزين الكالسيوم داخل الخلايا، الشبكة إندوبلازميك (إير) والسبيكوبلازمية أكثر تخصصا (سر) في خلايا العضلات. يتم بوساطة إطلاق ديناميكية من الكالسيوم من هذه العضيات من قبل مستقبلات ريانودين (رير) ومستقبلات إينوسيتول 1،4،5 ثلاثي الفوسفات (إب 3 R) مع إعادة التعبئة التي تحدث من خلال ساركو / إندوبلازميك ريسيكلوم مضخة الكالسيوم أتباس (سيركا). تم إنشاء جهاز استشعار الكالسيوم المشفر وراثيا (جيسي) يسمى كاتشر لمراقبة الإفراج عن الكالسيوم السريع من إير / سر. هنا، والبروتوكولات التفصيلية لترنسفكأيشن والتعبير عن تحسين، إير / سر المستهدفة جيسي الماسك + في HEK293 و C2C12 الخلايا وتطبيقه في رصد إب 3 R، ري، و سيركا بوساطة مضخة الكالسيوم عابرةs في HEK293 الخلايا باستخدام المجهر مضان موجزة. يتم تشتت ناهض مستقبلات أو مثبط الاختيار في حل الغرفة وتسجيل التغيرات كثافة في الوقت الحقيقي. مع هذه الطريقة، وينظر إلى انخفاض في الكالسيوم إير مع تفعيل ري مع 4-كلورو م- كريسول (4-سمك)، والتفعيل غير المباشر من إب 3 R مع أدينوسين ثلاثي الفوسفات (أتب)، وتثبيط مضخة سيركا مع سيكلوبازونيك حمض (كبا). نناقش أيضا بروتوكولات لتحديد في الموقع K د وتقدير القاعدي [كا 2 + ] في الخلايا C2C12. وباختصار، فإن هذه البروتوكولات، وتستخدم جنبا إلى جنب مع الماسك + ، يمكن أن تثير مستقبلات بوساطة الإفراج عن الكالسيوم من إير مع التطبيق في المستقبل لدراسة إير / سر أمراض الكالسيوم ذات الصلة.
Introduction
السمات المكانية والزمانية من الكالسيوم داخل الخلايا (كا 2 + ) العابرين تفعيل مختلف الوظائف البيولوجية 1 . يتم تشغيل هذه الأحداث كا 2 + إشارة خارج الخلية من خلال المحفزات المختلفة والسيطرة عليها داخل الخلايا من قبل كبير كا 2 + أورغانيل التخزين والعديد من كا 2 + مضخات وقنوات وكا 2+ البروتينات ملزمة. كا 2+ العابرين يمكن أن تتغير بشكل كبير نتيجة للعيوب مع إشارة التشكيل، مما يؤدي إلى أمراض مختلفة 2 . وبسبب سرعة وتعقيد نظام التشوير كا 2+ مع الشبكة النهائية والسلكوبلازمي (سر) في المركز، هناك حاجة إلى تحقيقات كا 2 + المشفرة وراثيا التي تم تحسينها لتعبير الثدييات مع حركية سريعة لمراقبة كا 2 + العالمية والمحلية التغييرات في خلايا مختلفة 3 .
و إير و سر، نظيره في خلايا العضلات، هي الخلايا الرئيسية كا 2 + العضيات التخزين وتعمل بمثابة كا 2 + المصارف التي تساعد على تضخيم كا 2 + إشارة 4 . و إير / سر هو جزء لا يتجزأ من كا 2 + يشير مع الأدوار المزدوجة كمرسل ومستقبل للإشارات 5 . مستقبلات ريانودين (رير) و إينوسيتول 1،4،5 ثلاثي الفوسفات مستقبلات (إب 3 R) هي كا 2+ مستقبلات الافراج الموجودة على أغشية إير / سر التي ينظمها كا 2 + 6 . عوامل أخرى تحفز بشكل مباشر أو غير مباشر وظيفة هذه المستقبلات. 4-كلورو- م- كريسول (4-سمك) هو ناهض قوية من رير، وجود حساسية أعلى 10 أضعاف من الكافيين لإحداث ريال كا 2 + الإفراج حيث يتم استخدام كلاهما بانتظام لدراسة ري بوساطة كا 2 + الإفراج في خلايا صحية ومريضة 7 . أتب يزيد إب 3- كايد 2 + إعادةالإيجار من خلال إب 3 R 8 . أتب يربط إلى مستقبلات بورينرجيك P2YR، مستقبلات G- البروتين المقترنة (غر)، مما اثار انتاج إب 3 الذي يربط إلى إب 3 R لاطلاق سراح كا 2 + من إير 9 ، 10 . و ساركو-إندوبلاسميك ريتيكولوم الكالسيوم أتباس مضخة (سيركا) هي مضخة P- نوع أتباس، وتقع أيضا على إير / سر الغشاء الذي يقلل من سعال عصبي كا 2 + ويغسل إير / سر عن طريق ضخ بنشاط أيون في تجويف إير / سر 11 – وتشمل مثبطات محددة من مضخة سيركا ثابسيجارجين، من ثابسيا غارغانيكا ، وحمض السيكلوبازونيك (كبا)، من الرشاشيات والبنسليوم . كبا لديه تقارب منخفض للمضخة وكتل عكسية كا 2 + نقطة الوصول 12 . ثابسيجارجين، من ناحية أخرى، يربط لا رجعة فيه إلى كا 2 + مضخة الحرة في بقايا F256 في الحلزون M3 مع نانومولأر التقارب 11 . تحليل وقياس التغيرات التي تنطوي عليها كا 2+ الأحداث حفز كان ولا يزال يشكل تحديا. منذ إير / سر هو تحت الخلية الرئيسية 2 + كا تحتوي على مقصورة مع وظيفة مركزية في نشر إشارة كا 2 + ، وقد ركز الكثير من العمل على فهم إير / سر كا 2 + يشير 5 .
خلق الاصطناعية كا 2 + الأصباغ ساعدت على التقدم في مجال وممارسة كا 2 + التصوير. على الرغم من أن الأصباغ، مثل ماج-فورا-2، قد استخدمت على نطاق واسع لقياس الكالسيوم المجزأة 2+ في خلايا مختلفة، 13 ، 14 ، 15 لديهم قيود مثل تحميل الصبغ غير المتكافئ، فوتوبلاشينغ، وعدم القدرة على أن تستهدف عضيات محددة . اكتشاف البروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) والنهوض بروتين الفلورسنت،على أساس كا 2 + تحقيقات دفعت مجال كا 2 + التصوير إلى الأمام 16 . بعض من جيسي الحالية هي فورستر نقل الطاقة الرنين (فريت) أزواج تنطوي على بروتين الفلورسنت الأصفر (يف)، سماوي الفلورسنت البروتين (سفب)، كالمودولين و M13 الببتيد ملزمة 17 ، 18 . تروبونين C- جيسيس كما تتوفر كما أزواج فريت من سفب والسترين وكما واحد فلورفور تحقيقات 19 ، 20 ، 21 . البعض الآخر، مثل GCAMP2 و R-غيكو هي أجهزة استشعار فلورفور واحدة تشمل كالمودولين 22 ، 23 . للتغلب على قيود الضيقة ضبط K د والتعاونية ملزمة المرتبطة الكالسيوم + 2 مواقع ملزمة وجدت في الكالسيوم 2+ مجالات ملزمة 24 ، فئة جديدة من الكالسيوم سينتم إنشاء سورس من خلال تصميم كا 2+ موقع ملزم على سطح برميل بيتا في موقع حساس كروموفور من تعزيز بروتين الفلورسنت الأخضر (إغف) 25 ، 26 . هذا الاستشعار توصف للغاية، ودعا الماسك، لديه K د من ~ 0.18 ملم، أك على مقربة من حد الانتشار، و أك من 700 ثانية -1 . وقد استخدمت الماسك لرصد مستقبلات بوساطة إير / سر الإفراج عن الكالسيوم في خطوط خلايا الثدييات المختلفة مثل هيلا، HEK293، و C2C12 25 . بسبب حركتها سريعة، كان يستخدم الماسك في الألياف العضلية المثنية ديجيتوروم (فدب) من الصغار والكبار صديق فيروس B نيه جاكسون (ففب) الفئران للكشف عن أن المزيد من كا 2 + لا يزال في ريال سعودي بعد 2 ثانية من الاستقطاب في فدب ألياف الفئران القديمة مقارنة مع الفئران الشابة 27 . للتغلب على مضان منخفضة في 37 درجة مئوية، مما يعيق تطبيقاته في التصوير الكالسيوم من الثديياتالخلايا، قمنا بتطوير نسخة محسنة من الماسك دعا الماسك + . الماسك + المعارض تعزيز مضان في 37 درجة مئوية لتطبيق أفضل في خلايا الثدييات. وأدرجت طفرات إضافية في الماسك لتحسين الحرارة ومضان في 37 درجة مئوية 28 ، 29 ، لخلق الماسك + . يظهر الماسك + زيادة ستة أضعاف في نسبة الإشارة إلى الضوضاء (شنر) على الماسك 30 .
هنا، يتم عرض البروتوكولات للثقافة وترنسفكأيشن من HEK293 و C2C12 الخلايا مع الماسك + وتطبيقها لرصد إير / سر العابرة بوساطة مستقبلات الكالسيوم. وتظهر النتائج التمثيلية لل كاتشر + أعرب في خلايا HEK293 تعامل مع 4-سمك، كبا و أتب. ونحن نقدم أيضا بروتوكول لتحديد في الموقع K د من الماسك + في الخلايا ميوبلاست C2C12 وكوانتيفيكاتيون من القاعدية [كا 2 + ].
Protocol
Representative Results
Discussion
يعيش التصوير خلية واحدة من تحقيقات الفلورسنت، مثل الماسك + ، هو تقنية فعالة لتحليل معقدة إير / سر كا 2 + عمليات الإشارات في كل خلية استجابة لناهضات مستقبلات أو الخصوم. هذه التقنية هي أيضا مفيدة للتصوير باستخدام موجات متعددة في وقت واحد، مثل الحاجة ل فورا-2 أو…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة GM62999، المعاهد الوطنية للصحة EB007268، المعاهد الوطنية للصحة AG15820، B & B منحة البذور، والمنحة نيه التكميلية لفر، بب زمالة إلى سم، زمالة دت ل رغ.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
Riferimenti
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochimica. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. . Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. . Calcium signaling protocols. , (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).
