目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング<sup> 2+</sup>センサーキャッチャー<sup> +</sup
Summary
我々は、リアルタイム蛍光顕微鏡法を用いて、HEK293および骨格筋C2C12細胞の小胞/筋小胞体（ER / SR）における急速なカルシウム過渡状態をモニタリングするための、標的遺伝子操作されたカルシウムインジケータ（GECI）CatchER + in situ K d測定および較正のためのプロトコルについても議論する。
Abstract
細胞外刺激によって誘発される細胞内カルシウム（Ca 2+ ）過渡応答は、生体内で多数の生物学的プロセスを開始する。細胞内カルシウム放出の中心には、主要な細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ、小胞体（ER）および筋細胞におけるより特化した筋小胞体（SR）がある。これらのオルガネラからのカルシウムの動的放出は、サルコ/小胞体カルシウムATPase（SERCA）ポンプを介して再充填するリアノジン受容体（RyR）およびイノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP 3 R）によって媒介される。 ER / SRからの急速なカルシウム放出をモニターするために、CatchERと呼ばれる遺伝的にコード化されたカルシウムセンサー（GECI）を作成した。ここで、HEK293およびC2C12細胞における改善されたER / SR標的GECI CatchER +のトランスフェクションおよび発現の詳細なプロトコールおよびIP 3 R、RyRおよびSERCAポンプ媒介性カルシウム一過性のモニタリングにおけるその適用sの蛍光顕微鏡を用いたHEK293細胞の概要を概説する。選択されたレセプターアゴニストまたは阻害剤は、チャンバー溶液中に分散され、強度変化がリアルタイムで記録される。この方法では、4-クロロ-m-クレゾール（4-cmc）によるRyR活性化、アデノシン三リン酸（ATP）によるIP 3 Rの間接活性化、およびシクロピアゾン酸によるSERCAポンプの阻害によりERカルシウムの減少が見られる酸（CPA）。また、 in situ K dを決定し、C2C12細胞の基底[Ca 2+ ]を定量するためのプロトコールについても議論する。要約すると、CatchER +と組み合わせて使用されるこれらのプロトコールは、ER / SRカルシウム関連病理の研究における将来の適用と共に、ERからの受容体媒介性カルシウム放出を誘発することができる。
Introduction
細胞内カルシウム（Ca 2+ ）過渡応答の時空間的な特性は、様々な生物学的機能を活性化する1 。これらのCa 2+シグナル伝達事象は、異なる刺激によって細胞外に誘発され、主要なCa 2+貯蔵オルガネラおよび多数のCa 2+ポンプ、チャネル、およびCa 2+結合タンパク質によって細胞内で制御される。 Ca 2+の過渡状態は、シグナルモジュレーションの欠陥の結果として大幅に変更され、異なる疾患2につながる可能性があります。中心にあるエンド – （ER）および筋小胞体（SR）を有するCa 2+シグナル伝達系の速度および複雑さのために、高速カイネティクスで哺乳動物発現のために最適化された遺伝子暗号化Ca 2+プローブが必要である異なる細胞における全球および局所Ca 2+変化を観察する3 。
ERとSR、筋肉細胞中のその対応物は、主要な細胞内Ca 2+貯蔵オルガネラであり、Ca 2+シグナルを増幅するのに役立つCa 2+シンクとして作用する4 。 ER / SRは、Ca 2+シグナリングの不可欠な部分であり、シグナルの送信と受信の2つの役割を担っています5 。リアノジン受容体（RyR）およびイノシトール1,4,5-三リン酸受容体（IP 3 R）は、Ca 2+ 6によって調節されるER / SRの膜上に位置するCa 2+放出受容体である。他の薬剤は、これらの受容体の機能を直接的または間接的に刺激する。 4-クロロ-m-クレゾール（4-cmc）はRyRの強力なアゴニストであり、両方ともRyR媒介性Ca 2+放出を研究するために定期的に使用されるSR Ca 2+放出を誘導するためにカフェインより10倍高い感度を有する健康な細胞と病気の細胞7 。 ATPはIP 3媒介性のCa 2+を増加させるIP 3 R 8をリースします。 ATPは、IP 3 Rに結合してER 9,10からCa 2+を放出するIP 3の産生を誘発する、プリン作動性受容体P2YR、Gタンパク質共役受容体（GPCR）に結合する。サルコ小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）ポンプは、細胞質Ca 2+を減少させER / SR内腔にイオンを能動的にポンピングすることによりER / SRを補充するER / SR膜上にも位置するP型ATPaseポンプである11 。 SERCAポンプの特異的阻害剤には、 アスペルギルス（Aspergillus ）およびペニシリウム（Penicillium）由来のタプシガルギン（thapsigargin ）、 タプシアガルガニカ （ Thapsia garganica）由来のタプシガルギン 、およびシクロピアゾン酸（CPA）が含まれる。 CPAはポンプに対する親和性が低く、Ca 2+アクセスポイント12を可逆的にブロックする。一方、タプシガルギンは、M3らせん中の残基F256のCa 2+遊離ポンプに不可逆的に結合するアフィニティー11 。 Ca 2+刺激事象に関与する変化を分析し、定量化することは、依然として課題であり、依然として課題である。 ER / SRは、Ca 2+シグナルの伝播における中心的機能を有する主要な細胞内Ca 2+含有区画であるので、多くの研究がER / SR Ca 2+シグナル伝達5の理解に集中している。
合成Ca 2+色素の生成は、Ca 2+イメージングの分野および実践を進歩させるのに役立った。 Mag-Fura-2のような色素は、異なる細胞（13,14,15）の区画化されたCa 2+を測定するために広く使用されているが、それらは不均一色素負荷、光退色、および特定の細胞小器官。緑色蛍光タンパク質（GFP）の発見および蛍光タンパク質 – タンパク質複合体の進歩は、Ca 2+プローブはCa 2+イメージングの分野を推進している16 。いくつかの既存のGECIは、黄色蛍光タンパク質（YFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、カルモジュリンおよびM13結合ペプチド17,18を含むフォルスター共鳴エネルギー移動（FRET）対である。トロポニンCに基づくGECIはまた、CFPおよびシトリンのFRET対として、および単一フルオロフォアプローブとして19,20,21として利用可能である。 GCaMP2およびR-GECOのような他のものは、カルモジュリンを含む単一のフルオロフォアセンサーである（ 22,23） 。それらのCa 2+結合ドメイン24に見られる複数のCa 2+結合部位に関連するK dおよび協同的結合の狭いチューニングの限界を克服するために、新規クラスのカルシウムセン細胞は、増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP） 25,26の発色団に感受性の高い位置で、βバレルの表面上にCa 2+結合部位を設計することによって作製された。 CatchERと呼ばれるこの高度に宣伝されたセンサーは、〜0.18mMのK d 、拡散限界近くのak、および700s -1の ak オフを有する。 CatchERは、HeLa、HEK293、およびC2C12 25のような異なる哺乳動物細胞株における受容体媒介ER / SRカルシウム放出をモニターするために使用されている。その速い動態のために、FDBにおいて2秒の脱分極の後に、より多くのCa 2+がSRに残ることを明らかにするために、若いおよび古いフレンドウイルスB NIHジャクソン（FVB）マウスのflexor digitorum brevis（FDB）筋繊維においてCatchERを使用した老齢マウスの繊維は若いマウスの繊維と比較して27 。 37℃でのその低い蛍光を克服するために、哺乳動物のカルシウムイメージングにおけるその応用を妨げているCatchER +と呼ばれるCatchERの改良版を開発しました。 CatchER +は、哺乳動物細胞でのより良い適用のために、37℃で蛍光を増強する。追加の突然変異をCatchERに組み込み、CatchER +を作製するために37℃で熱安定性および蛍光性を改善した。 CatchER +は、CatchER 30よりも信号対雑音比（SNR）が6倍に向上しています。
ここでは、CatchER +を用いたHEK293およびC2C12細胞の培養およびトランスフェクションのためのプロトコールおよびER / SRレセプター媒介カルシウム過渡状態をモニターするためのその適用が提示される。代表的な結果は、4-cmc、CPAおよびATPで処理したHEK293細胞で発現したCatchER +について示されている。本発明者らは、C2C12筋芽細胞およびQuaにおけるCatchER +の in situ K dを決定するためのプロトコールも提供する基底[Ca 2+ ]の存在化。
Protocol
Representative Results
Discussion
CatchER +のような蛍光プローブのライブシングルセルイメージングは、レセプターアゴニストまたはアンタゴニストに応答する各細胞の複雑なER / SR Ca 2+シグナル伝達プロセスを分析するのに有効な技術である。この技術は、Fura-2に必要なように複数の波長を同時に使用してイメージングを行う場合や、ERおよびサイトゾルカルシウムの両方の変化をそれぞれ監視するため?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH GM62999、NIH EB007268、NIH AG15820、B＆B種子グラント、NIH補完グラント、FR、BBフェローシップ、CM、RGへのCDTフェローシップによって資金提供されました。
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
Riferimenti
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochimica. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. . Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. . Calcium signaling protocols. , (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).
