Summary
Endothélium vasculaire contrôle étroitement le recrutement des leucocytes. Extravasation de leucocyte inadéquate contribue aux maladies inflammatoires humaines. La recherche de nouveaux éléments régulateurs d’activation endothéliale est donc nécessaire de concevoir des traitements améliorés pour troubles inflammatoires. Nous décrivons ici une méthodologie globale afin de caractériser les nouveaux régulateurs endothéliales qui peuvent de modifier leucocytes traite au cours de l’inflammation.
Abstract
La couche endothéliale est essentielle au maintien de l’homéostasie du corps par le contrôle de nombreuses fonctions différentes. Régulation de la réponse inflammatoire par la couche endothéliale est cruciale pour lutter efficacement contre entrées nuisibles et aider à la restauration des zones endommagées. Lorsque les cellules endothéliales sont exposés à un environnement inflammatoire, tels que le composant externe de la membrane des bactéries à Gram négatif, lipopolysaccharide (LPS), ils expriment des cytokines pro-inflammatoires solubles, tels que Ccl5, Cxcl1 et Cxcl10 et déclencher le activation des leucocytes circulants. En outre, l’expression des molécules d’adhésion E-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1 sur la surface endothéliale permet l’interaction et l’adhésion des leucocytes activés à la couche endothéliale et finalement l’extravasation vers les tissus enflammés. Dans ce scénario, la fonction endothéliale doit être étroitement contrôlée car l’activation excessive ou défectueuse dans le recrutement des leucocytes pourrait conduire à des troubles inflammatoires liés. Étant donné que beaucoup de ces troubles n’ont pas un traitement efficace, des stratégies nouvelles en mettant l’accent sur la couche vasculaire doivent être étudiés. Nous vous proposons les tests complets qui sont utiles à la recherche de nouveaux régulateurs endothéliales qui modifient la fonction leucocytaire. Nous analysons une activation endothéliale en utilisant des objectifs d’expression spécifiques impliqués dans le recrutement des leucocytes (par exemple, des cytokines, chimiokines et molécules d’adhésion) avec plusieurs techniques, y compris : (réaction en chaîne de polymérase quantitative en temps réel RT-qPCR), western blot, flow cytometry et adhérence des essais. Ces approches déterminer la fonction endothéliale dans le contexte inflammatoire et sont très utiles pour effectuer des tests de dépistage afin de caractériser les nouveaux régulateurs inflammatoires endothéliales qui sont potentiellement utiles pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Introduction
L’inflammation est une réaction biologique bénéfique contre les agents infectieux, avec l’objectif majeur d’éliminer l’agent pathogène et de réparer le tissu endommagé. Sous certaines conditions, telles que des infections chroniques ou des maladies auto-immunes, l’inflammation n’est pas résolu. Au lieu de cela, il y a une réaction aberrante avec infiltration continue des leucocytes, ce qui entraîne une réponse immunitaire prolongée qui mène à des lésions tissulaires, fibrose, perte de fonction et ensemble, handicap et dans la mort de certains cas du patient. Ces affections humaines, cataloguées comme des maladies inflammatoires, comportent tous les vaisseaux sanguins pour le contrôle de l’extravasation de leucocyte1,2.
Les cellules endothéliales jouent un rôle fondamental dans la régulation de la réponse inflammatoire en contrôlant le trafic leucocytaire. Lorsque la couche endothéliale est exposée à des médiateurs inflammatoires tels que LPS, l’endothélium de repos active et exprime des cytokines pro-inflammatoires (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) et des molécules d’adhésion (E-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1) cette faveur recrutement des leucocytes au site d’infection circulants. Les leucocytes amorcées par les cytokines libérées puis médient laminage et interaction avec la couche endothéliale par les homologues adhésifs correspondants : se-1 à la sélectine intégrine α4β1 VCAM-1 et l’intégrine αLβ2 à l’ICAM-1. Enfin, les leucocytes migrent à travers le système vasculaire vers la mise au point d’inflammation3.
Le rôle essentiel de l’endothélium dans la régulation de la réponse inflammatoire a été démontré sur des souris génétiquement modifiées pour exprimer les récepteurs LPS, récepteur toll-like 4 (TLR4), uniquement sur les cellules endothéliales. Ces animaux endothéliales TLR4 ont été en mesure de répondre à une inflammation induite par LPS et à détecter l’infection générée après l’inoculation de la bactérie et par conséquent obtenir résolution de l’infection et la survie à des niveaux semblables comme les souris de type sauvage4 , 5.
Pour la voie de la réponse inflammatoire réglementées par l’endothélium, il a été postulé que l’inhibition à certains stades de l’interaction de leucocytes-endothélium entraînerait la réduction de la migration trans-endothélial et un meilleur pronostic pour maladies inflammatoires. En fait, plusieurs stratégies ciblant l’interaction d’activation et de leucocytes-endothélium endothéliale ont été conçus pour entraver l’extravasation des cellules immunitaires comme un traitement pour troubles inflammatoires6,7.
Dans ce rapport, nous décrivons un groupe approfondi des techniques in vitro de pour caractériser complètement l’activité endothéliale en réponse aux stimulus inflammatoire LPS et son rôle dans l’activation des leucocytes et adhérence à la couche vasculaire. Le modèle de cellules endothéliales utilisé dans ce manuscrit était de la lignée de cellules endothéliales pulmonaires de souris (LTCE-04), tel que décrit par Hortelano et al. 8. the LTCE-04 la lignée cellulaire a été validée dans la littérature d’un système approprié d’étudier une activation endothéliale9,10. Basé sur les intérêts de recherche, ces approches peuvent être facilement extrapolés à toute endothéliale ou systèmes de leucocytes et profil inflammatoire. Une fois définis les paramètres endothéliales dans les conditions choisies, le système peut tester de nouveaux médicaments sur l’expérimentation proposée pour évaluer l’activation vasculaire. Dans ce contexte inflammatoire, les cellules de l’endothélium, testés avec le composé d’intérêt peuvent être comparées à des conditions de contrôle des cellules, et toute différence qui en résulte peut informer le résultat pronostique du médicament sur le développement et la progression de l’inflammation. Pour conclure, nous proposons un système pertinent afin de caractériser les nouvelles cibles de médicaments aux cellules endothéliales, qui peuvent influer sur la conception de nouvelles thérapies vasculaires spécifiques contre les maladies inflammatoires.
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Protocol
1. Culture de cellules endothéliales
- plaques traitée pour la culture de tissu
- manteau 100 mm plaques de culture de tissus avec de la gélatine de 2,5 mL de solution (autoclavés, 0,1 % de gélatine dans l’eau distillée) pendant 30 min à 37 ° C ; cette peuvent être extrapolés au format bien nécessaire. Aspirer la solution de gélatine et laisser les plaques à sécher à l’air dans la hotte de vitroplants.
- Des conditions de culture de tissus
- cultiver les cellules LTCE-04 à l’intérieur d’un incubateur biologique (37 ° C, humidité de 95 %, 5 % de CO 2). Cultiver des cellules en milieu complet de Dulbecco ' s Modified Eagle moyenne : mélange de nutriments F-12 (DMEM/F-12) additionné de 10 % sérum bovin fœtal (SVF) et 100 unités/mL de pénicilline et de streptomycine 100 µg/mL (P/S).
- Compter les cellules par la méthode standard de chambre Neubauer et ajouter les cellules LTCE-04 pour les plaques de gélatine imprégnées de 100 mm dans 10 mL de milieu complet, à faible densité de 2-11 x 10 4 cellules/cm 2. Fractionner les cellules 1:3, lorsqu’ils atteignent la confluence.
NOTE : Ceci se produit généralement après deux à trois jours de culture. - Repiquer les cellules de la vaisselle avec 10 mL stérile Phosphate Buffered Saline (PBS), suivi en ajoutant 2 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25 % de trypsine, 5 mM EDTA) et incuber pendant 3 min à 37 ° C.
- Arrêter la réaction de la trypsine-EDTA et récupérer les cellules en suspension en ajoutant 10 mL de milieu complet. Tournez en bas des cellules (300 x g, 5 min), éliminer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans les médias complet et sous-culture convenablement.
2. Traitement de LPS et médiateurs
- les cellules LTCE-04 de médias complet à confluence auxiliaire dans le format suivant bien sur plaque : 7 x 10 5 cellules/puits sur plaques 6 puits et 2,5 x 10 5 cellules/puits sur des plaques de 96 puits.
- Incuber la culture pendant 6 h dans un incubateur à cellules (37 ° C, humidité de 95 %, 5 % de CO 2). Placez-vous dans les cellules des médias incomplètes (DMEM-F12, P/S) et laisser une nuit ou plus (ON) à synchroniser et à réduire l’activité des cellules.
- Enlever les médias et tester de nouveaux composés pharmacologiques en incubant les cellules endothéliales avec (ou sans) la drogue en question (p. ex. DT 10) dilué dans les médias incomplètes (30 min, 37 ° C) ; ajouter 1,4 mL/ainsi pour plaque 6 puits ou 0,14 mL/puits pour plaques 96 puits).
- Remettre les cellules en ajoutant des LPS au milieu d’incubation (100 ng/mL, la concentration finale) pour la période précisée dans chaque essai. Utiliser des PBS comme un contrôle.
3. Évaluation du profil transcriptionnel sur l’endothélium activé par RT-qPCR
- cellules de semences la LTCE-04 au confluent des 6 puits culture plaques (7 x 10 5 cellules/puits). Incuber pendant 6 h (37 ° C, humidité de 95 %, 5 % de CO 2) et ensuite procéder à la privation de sérum (ON d’incubation).
- Enlever les médias et les traiter (ou ne pas traite) la cellule endothéliale cultures avec le médicament d’intérêt dilué dans les médias incomplètes (incuber 30 min, 37 ° C) ; ajouter 1,4 mL/ainsi pour plaque 6 puits (30 min, 37 ° C).
- Remettre les cellules en ajoutant 100 ng/mL LPS aux médias couvés (comme indiqué au point 2.3) et incuber pendant 6 h. arrêter la réaction de laver deux fois avec du PBS froid et garder les plaques à-80 ° C jusqu’au traitement des échantillons.
- Extraction de l’ARN
- décongeler les plaques et ajoute 1 mL/puits RNA extraction tampon (38 % de phénol et l’isothiocyanate de guanidinium 0,8 M ; Voir le tableau des matériaux). Laissez pendant 30 min à température ambiante (RT) sous agitation et collecter l’homogénat en tubes de 1,5 mL.
- Ajouter 200 chloroforme µL et agitez doucement pendant 15 s. Incuber pendant 3 min à RT et centrifuger (11 600 x g, 15 min, 4 ° C).
- Transférer la phase aqueuse dans un autre tube de 1,5 mL. Précipiter RNA en ajoutant 500 µL isopropanol, suivie d’une incubation de 10 min à RT puis centrifugation (11 600 x g, 4 ° C).
- Jeter le surnageant et le culot avec 75 % d’éthanol de lavage par agitation vortex et puis centrifugation (7 500 x g, 4 ° C).
- Sécher le culot et solubiliser RNA dans 25 µL pur H 2 O en incubant pendant 10 min à 55 ° C. garder RNA à-80 ° C jusqu’au traitement des échantillons.
- Quantité et la pureté de l’ARN
- quantifier la concentration d’ARN en mesurant l’absorbance de l’échantillon à 260 nm dans un spectrophotomètre (voir Table des matières).
- Mesure à 230 nm et 280 nm pour déterminer la pureté de la RNA.
Remarque : Le ratio 260/280 indique une contamination de protéine ou du phénol. Un ratio proche de 2 est acceptable. Le ratio 260/230 indique EDTA, les glucides ou les contaminants de phénol. Les valeurs entre 2.0-2.2 sont acceptables.
- RNA vérifiant l’intégrité
- Run 2 µg d’ARN total ou d’un ARN de ladder sur un 1,5 % gel d’agarose de dénaturation ; visualiser sur un système de documentation de gel (voir Table des matières).
Remarque : Un ratio de 2:1 de claires et nettes bandes ARNr 28 s et 18 s indique un ARN intact. Partiellement dégradés RNA se résout comme une apparence barbouillée.
- Run 2 µg d’ARN total ou d’un ARN de ladder sur un 1,5 % gel d’agarose de dénaturation ; visualiser sur un système de documentation de gel (voir Table des matières).
- RT-qPCR
- faire la synthèse de l’ADN complémentaire (ADNc) d’un ARN brin unique suivant la norme du protocole (voir Table des matières), 11.
- Évaluer l’expression des gènes de la RT-qPCR
- préparer le mélange réactionnel pour chaque échantillon : mélanger 2 µL cDNA, 7 composé fluorescent µL, apprêt avant de 300 nM et 300 nM inverse l’apprêt (tableau 1) dans un un volume final de 13 µL et ajouter à la plaque 96 puits (voir Table des matières).
- Sceller la plaque avec une optique protectrice adhésive, centrifugeuse (300 x g, 1 min) et exécutez la réaction sur un système de PCR en temps réel (démarrage à chaud 95 ° C pendant 20 s suivie de 40 cycles : 95 ° C pour 3 s et 60 ° C pendant 30 s) (voir la Table des matières).
- Analyser les résultats de quantification relative à l’aide de la méthode comparative 2 -ΔΔCt avec le ménage gènes glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ou acides ribosomique phosphoprotéines P0 (36B4) 12 .
4. Évaluer l’Activation endothéliale par cytométrie en flux
- traiter les cellules LTCE-04 suivant les conditions décrites à l’article 2 et à évaluer les changements dans les protéines de surface endothéliales par cytométrie.
- Détacher les cellules après 6 h de stimulation LPS avec la méthode de la trypsine-EDTA décrite dans l’étape 1.2.3 et lavez avec les médias incomplètes à 4 ° C.
- Compter les cellules à l’aide de la méthode de chambre Neubauer et placer 10 x 10 4 cellules en plaques 96 puits u-bas. Centrifugeuse (300 x g, 5 min) et jeter surnageant par un 180° snap du poignet du haut au bas et restauration rapide sur sa position initiale.
- Ajouter 50 µL de l’anticorps sélectionnés dilué dans les médias incomplètes (10 µg/mL, la concentration finale) aux cellules et incuber (30 min, 4 ° C).
- Laver les cellules deux fois wvec les médias incomplètes suivant la procédure décrite à l’étape 4.3 et incuber avec 50 µL à 10 µg/mL de l’anticorps secondaire correspondant couplé à la FITC ou un conjugué similaire (30 min, 4 ° C dans un espace obscur).
- Laver les cellules une fois avec les médias incomplètes suivies d’un lavage de PBS. Récupérer les cellules avec 300 µL PBS à l’aide de pointes de pipette de 1 mL et placer dans des tubes de cytométrie en flux.
- Évaluer les échantillons dans le système de cytométrie de flux (voir Table des matières). Ajuster la population cellulaire par l’avant et les paramètres de diffusion de côté. Porte la population d’intérêt. Ajuster les portes basés sur le contrôle négatif de cellules incubées avec le contrôle de l’isotype. Analyser les résultats sous forme de pourcentage des cellules positives ou moyenne intensité de fluorescence 8.
5. Évaluer une Activation endothéliale par Western Blot
- graines de l’endothélium au confluent des plaques 6 puits culture (7 x 10 5 cellules/puits) et traiter avec le LPS, tel que décrit à l’article 2. Analyser l’expression de la protéine inflammatoire par le protocole de transfert de western suivant.
- Arrêter la stimulation de LPS à différents moments afin d’élucider les différents aspects de la réponse endothéliale :
- vérifier le profil de protéines inflammatoires après 6 h de stimulation LPS.
- Déterminer la cellule signalisation toutes les 15 min pendant une période de 60 min.
- Dans les deux cas, arrêter la réaction de laver deux fois avec du PBS froid et stocker les échantillons à-80 ° C jusqu’au traitement des échantillons. Tampon
- Lyse des cellules et l’extraction de la protéine
- lyse d’ajouter 200 µL à chaque puits (1 % tensioactif non ionique, 10 mM Tris-HCl, EDTA, chlorure de sodium 150 mM, pyrophosphate de sodium de 30 mM, 50 mM le fluorure de sodium, orthovanadate de sodium 2,1 mM à 1 mM pH de 7,6, additionné de cocktail inhibiteur de protéase) (voir la table des matières).
- Incuber pendant 15 min à 4 ° C sous agitation, gratter les puits avec une pointe de pipette et recueillir l’homogénat en tubes de 1,5 mL.
- Centrifuger les tubes à 11 600 x g à 4 ° C.
- Conserver le surnageant dans tubes propre de 1,5 mL à-80 ° C, jusqu'à transformation.
- Mesure la concentration de protéine par l’essai acide de bicinchoninic, suivant la norme du protocole (voir table des matières) 13.
- Résoudre les 30 µg de lysat pour chaque échantillon de protéines totales par la technique standard de dodécyl sulfate de sodium 0.1 %, 10 % de polyacrylamide gel électrophorèse (SDS-PAGE) 14. Exécuter les exemples avec 10 mM β-mercaptoéthanol (conditions réductrices) ou sans (conditions non réducteur) selon l’anticorps utilisé pour détecter la protéine d’intérêt.
- Transférer les protéines séparées du gel de polyacrylamide à une membrane de transfert de polyvinylidène difluoride (PVDF) avec 0,45 µm taille de pore à l’aide de la procédure standard.
- Après transfert, laver la membrane deux fois avec du PBS, 0,1 % polysorbate-20 (PBS-T) et bloquer les sites de liaison non-spécifique en ajoutant 20 mL 2 % de BSA dilué dans du PBS-T pour les phosphoprotéines détectés ou 5 % non-lait écrémé en PBS-T pour les protéines totales, sous agitation (90 min, RT).
- , Diluer l’anticorps sélectionnés dans 10 mL de tampon bloquant approprié à la concentration recommandée et incuber la membrane sous agitation (ON, 4 ° C). Vous pouvez également placer la membrane dans un sac en plastique scellé et utilisé 5 mL de l’anticorps dilué.
- Lendemain, laver la membrane trois fois (excès PBS-T, 15 min, RT).
- Incuber la membrane sous agitation (30 min, RT) avec 10 mL de l’anticorps secondaire correspondant liée à la peroxydase de raifort (HRP) diluée au 1/10 000 dans le tampon de blocage approprié.
- Laver la membrane trois fois sous agitation (excès PBS-T, 15 min, RT).
- Incuber la membrane pendant 1 min avec 0,1 mL/cm 2 de la chimiluminescence de substrat amélioré de peroxydase (ECL). Placer la membrane drainée entre deux feuilles de plastique transparents et l’insérer dans le système de détection par chimiluminescence qui comprend une caméra de dispositif de couplage de charge (CCD).
- La caméra CCD permet de détecter le signal et son logiciel pour enregistrer des images avec le programme accumulatif (images afficheront le signal accumulé, à l’exposition de chaque 30 s pour une durée totale de 15 min).
- Quantifier l’intensité de la bande par densitométrie en utilisant le logiciel ImageJ suivant le protocole décrit dans le guide utilisateur 15.
- Ouvrir l’échantillon dans le logiciel ImageJ et sélectionnez le groupe d’intérêt avec l’outil de sélection rectangulaire.
- Sélectionner comme la première voie et presse tracer des voies pour obtenir les profil de parcelles.
- Délimiter la zone des pics avec la sélection linéaire.
- Mesurer la taille de chaque bande en cliquant à l’intérieur de chaque pic.
- Représentent les résultats en ce qui concerne le contrôle de la protéine (β-actine, tubuline, etc.) de chargement.
6. Évaluer endothéliales facteur libéré de leucocyte Activation de tests d’adhérence
- obtenir les milieux conditionnés endothéliales.
- Traiter les cellules LTCE-04, tel qu’indiqué à l’article 2 et recueillir le surnageant de culture après stimulation 24h avec LPS (100 ng/mL).
- Recueille les milieux conditionnés de la LTCE-04 les cellules traitées et la centrifugeuse (600 x g). Garder le surnageant en aliquotes de 0,5 mL à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
- Essai d’adhérence leucocytaire
- enduire les plaques 96 puits avec 50 µL/puits des protéines de la matrice extracellulaire sélectionné dilué dans du PBS (à l’exception de collagène, qui est dilué dans de l’acide acétique 0,1 M) : la fibronectine (1 à 10 µg/mL ), laminine (1 à 10 µg/mL) et du collagène de type I (10 à 40 µg/mL). ON congé à 4 ° C.
- Jetez les médias couchés et bloquer les sites de liaison non-spécifique sur les puits avec 150 µL de PBS, 1 % de BSA inactivés par la chaleur (1 min, 100 ° C) pendant 90 min à température ambiante. Laver les puits deux fois avec du PBS et ajoutent 100 µL de prélevés antérieurement endothéliales conditionné médias (section 6.1) dans les puits de
- .
Remarque : Les plaques sont prêts pour la réalisation de l’essai d’adhérence. - La lignée de cellules de monocytes-macrophages J774 souris dans un incubateur biologique (37 ° C, humidité de 95 %, 5 % de CO 2) de la culture avec la Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI), 10 % BF, 1 % P/S.
Remarque : Les cellules J774 cultiver en suspension. - Recueillir les cellules J774 dans un tube de 15 mL et centrifuger (300 x g, 5 min). Jeter le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire avec 10 mL de milieu sans sérum. Compter les cellules dans une chambre de Neubauer. Centrifuger les cellules (300 x g, 5 min), éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules en milieu sans sérum à 15 x 10 4 J774 cellules / 50 médias µL.
- Ajouter 15 x 10 4 J774 cellules à chacun bien dans un milieu sans sérum 50 µL et incuber pendant 15 min à 4 ° C, suivie de 1 h à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 cell.
- Laver les puits deux fois, délicatement en ajoutant PBS chaud ; centrifuger (300 x g, 5 min) et jeter le surnageant par un composant logiciel enfichable de 180° du poignet du haut au bas et restauration rapide sur sa position initiale. Difficulté la cellule attachées en ajoutant 100 µL/puits de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans du PBS et incuber (10 min, RT).
- Jeter les médias doucement et permeabilize les cellules avec du méthanol de 2 % dans du PBS pendant 2 min à RT. Jetez les médias doucement et tacher les cellules en ajoutant 50 µL/puits de violet de gentiane 0,5 % à 20 % de méthanol pour 90 s à RT.
- Laver la plaque abondamment à l’eau courante, jeter le liquide en excès et laissez-le sécher à l’air. Signaler les cellules attachées par appareil photo numérique couplé à un photomicroscope.
- Diluer la cellule, la coloration en ajoutant 100 µL/puits de citrate de sodium 0,1 M, 50 % d’éthanol. Mesurer l’absorbance à 545 nm et représentent les résultats en unités arbitraires d’absorbance ou pourcentage d’adhérence en tenant compte de 100 % comme adhésion cellulaire atteint aux puits recouverts de plus forte concentration de ligand
7. Tester l’Activation endothéliale par dosage co adhérence leucocytaire-endothélium
- traiter les cellules LTCE-04 sur les plaques à 96 puits, tel que décrit à l’article 2 et incuber avec LPS (6 h, 37 ° C).
- Fluorescent étiqueter cellules J774 avec carboxyfluorescéine Succinimidyl Ester (CSFE).
- Laver les J774 cellules dans du PBS suivant la procédure en 6.2.5. Compter les cellules par le Neubauer méthode de chambre et remettre en suspension à 1 x 10 6 cellules/mL dans du PBS, 0,1 % de BSA.
- Incuber les cellules avec CFSE (5 µM, concentration finale) pendant 20 min à 37 ° C. Ajouter 5 mL incomplète de milieu et incuber (5 min, 4 ° C).
- Laver une fois avec les médias incomplètes comme expliqué en 6.2.5., remettre en suspension à 15 x 10 4 cellules/100 µL et procéder à l’essai d’adhérence Co.
- Après le traitement de l’endothélium, laver les puits trois fois avec les médias incomplètes. Ajouter cellules J774-CFSE (15 x 10 4 cellules/100 µL) dans chaque bien endothéliales enduit. Incuber la plaque pendant 10 min à 4 ° C, suivie de 60 min à 37 ° C.
- Laver les puits doucement, comme décrit dans 6.2.7., à l’aide de PBS préchauffé et signaler l’adhérence J774 à la couche endothéliale par deux méthodes suivantes :
- lyser les cellules à 0,1 M Tris-HCl pH 8,8, 1 % SDS (100 µL/puits) et mesurer la CFSE-J774 signal par fluorimétrie (excitation/émission = 492 nm/517 nm). Représenter les résultats en unités arbitraires de l’intensité de la fluorescence ou le pourcentage d’adhésion en ce qui concerne le contrôle positif (signal de cellules totales ajoutés dans chaque cupule).
- Fixer les cellules chez 4 % PFA et rapport à la fixation des cellules J774-CFSE à l’endothélium en visualisant sous un microscope à fluorescence (excitation/émission = 492 nm/517 nm).
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Representative Results
Évaluation de l’activation de la cellule endothéliale induite par LPS par RT-qPCR
Les cellules de LTCE-04 sérum affamé ont été stimulées par 100 ng/mL de LPS pendant 6 h, et l’expression du gène endothéliales a été évaluée à l’aide de RT-qPCR en comparant l’expression des marqueurs d’activation à l’état de repos. Comme le montre la Figure 1 a, les cellules incubés LPS LTCE-04 induit l’expression de l’ARNm sélectionné de molécules d’adhérence impliquées dans le recrutement des leucocytes au cours de la réponse inflammatoire (E-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1). PECAM-1 a été utilisée comme témoin interne car l’expression est non modifiée sous ce traitement expérimental. Figure 1 b représente l’activation endothéliale par LPS, mesurée par l’augmentation de l’expression ARNm des cytokines Ccl5, Cxcl10 et Cxcl1. Ces molécules sont impliqués dans l’activation des leucocytes, y compris leur trafic à la couche endothéliale et extravasation ultérieure sur le site de l’inflammation circulants. La cytokine, IL4, a été utilisée comme témoin interne sous ce traitement expérimental.
Figure 1 : évaluation d’induite par LPS endothéliale cellules activation par RT-qPCR. Le LTCE-04 cellules sont stimulées avec 100 ng/mL de LPS pendant 6 h (barres rouges) par rapport à la condition de contrôle (barres bleues), et l’expression des gènes a été analysée par RT-qPCR. Les graphiques montrent pli induction de l’ARNm en ce qui concerne la condition de contrôle sélectionné endothéliale des molécules d’adhésion (A) et (B) des cytokines impliquées dans l’activation des leucocytes et de recrutement au cours de la réaction inflammatoire. PECAM-1 et IL4 ont été utilisés comme témoins négatifs sous cette condition. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM d’une des expériences, des trois exécutés, réalisée en trois exemplaires. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Expression de la protéine de molécules d’adhérence sur les cellules endothéliales LPS-traités
Stimulation inflammatoire a été réalisée sur les cellules LTCE-04, tel que décrit dans la section précédente, et l’expression de la protéine a été étudiée par la technique de western blot. L’endothélium au repos présente presque indécelables des molécules d’adhérence VCAM-1 et ICAM-1 (étiquetée-). En présence de LPS (+), le phénotype endothélial activé est évident par la régulation de l’expression des marqueurs décrits (Figure 2). Les membranes ont été normalisées par détection de β-actine, ce qui a été utilisée comme le contrôle de chargement pour calculer les densités de bande relative après analyse de densitométrie.
Figure 2 : expression de la protéine de molécules d’adhérence sur les cellules endothéliales LPS-traités. La tache occidentale représentant évaluation VCAM-1 et ICAM-1 expression de la protéine en repos (-) par rapport à LPS-traités (+) cellules LTCE-04. La β-actine a été utilisé comme un contrôle de chargement. Le poids moléculaire de chaque protéine est entre parenthèses. Les valeurs représentent la semi-quantification de la densité relative de bande. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Marqueurs de surface endothéliales dans l’inflammation induite par LPS
L’activation endothéliale dans le contexte inflammatoire a été évaluée par cytométrie en flux après 6 heures-stimulation par le LPS (100 ng/mL). Dans ces conditions, la détection de molécules liées à adhésif impliqués dans l’interaction de leucocytes a été évaluée. Le panneau de gauche de la Figure 3 représente expression basale des marqueurs spécifiés dans les cellules au repos de la LTCE-04 (rouge-solid histogramme) par rapport au témoin négatif isotype (histogramme en pointillés noir). Le panneau de droite de la Figure 3 montre les résultats dérivés stimulée LTCE-04. Le traitement de LPS significativement augmenté l’expression des molécules d’adhésion E-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1 dans la membrane plasmique (rouge-solid histogramme) par rapport à l’état de repos (histogramme en pointillés noir). Comme le montre la cytométrie profils ainsi que cité précédemment, l’expression de PECAM-1 est inchangée dans cette condition expérimentale. Figure 3 b indique les valeurs de quantification utilisés comme références pour évaluer les possibles médiateurs de la réaction inflammatoire endothéliale. % : pourcentage de cellules positives ; IFM : moyenne intensité de fluorescence.
Figure 3 : les marqueurs de surface endothéliales dans l’inflammation induite par LPS. Flow cytometry profils des molécules d’adhérence cellulaire sur le repos et les cellules stimulées par LPS LTCE-04. Le panneau de gauche montre l’expression de la protéine sur les cellules au repos (histogramme de rouge étiqueté antigène) en ce qui concerne le contrôle de l’isotype apparié (histogramme Ctrl-noir). Le panneau de droite compare l’expression de protéine de cellule-surface de contrôle (histogrammes noirs) aux cellules endothéliales LPS-traités (histogramme rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Voies de signalisation déclenchées par la stimulation de LPS dans les cellules endothéliales
Les mécanismes impliqués dans l’activation du compartiment vasculaire au cours de l’inflammation sont étudiées en évaluant des molécules de signalisation clés. Les LTCE-04 les cellules stimulées par LPS à différentes époques ont été traitées pour l’extraction de la protéine, et le degré d’activation a été analysé par la technique de western blot. La figure 4 montre que le répresseur IκB-α de signalisation NF-κB est phosphorylé après les 15 min d’incubation LPS et renvoie aux taux de base après 1 heure. En revanche, les LPS active ERK 1/2 de signalisation après 15 min, qui établit une voie essentielle impliqués dans l’activation endothéliale au cours de la réaction inflammatoire. Les membranes ont été normalisées par β-actine ou ERK 1/2 de détection, qui étaient utilisés comme les chargement des contrôles pour calculer les densités de bande relative après analyse de la densitométrie.
Figure 4 : Signaling pathways déclenchées par LPS sur les cellules endothéliales. Les cellules LTCE-04 stimulées avec 100 ng/mL de LPS dans les temps indiquent sur la figure et les voies de signalisation ERK 1/2 (P-ERK 1/2) et NF-kB (au moyen de P-IκBα) ont été évalués par western blot. Le ERK 1/2 total et β-actine ont été utilisés comme contrôles dans chaque condition de chargement. Le poids moléculaire de chaque protéine est entre parenthèses. Les valeurs représentent la semi-quantification de la densité relative de bande. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie dece chiffre.
Règlement du comportement leucocytes par endothélium stimulée par LPS
La pertinence biologique de la régulation de l’activation endothéliale sur la progression de la réaction inflammatoire est déterminée par des essais fonctionnels de la performance de leucocytes. Comme décrit dans la section protocole, deux approches différentes sont incluses pour tester la fonction leucocytaire réglementée par les cellules endothéliales. Bien que les dosages interrogent les différents aspects de la réponse inflammatoire (RT-qPCR pour endothéliales cytokines libérées par l’activation des leucocytes et tache occidentale pour des molécules d’adhérence endothéliale dans l’interaction de leucocytes), les données obtenues sont les deux évaluent les détails microscopiques de l’attachement de leucocytes. L’activation des leucocytes par des facteurs solubles endothéliales est essentielle pour le développement d’une réaction inflammatoire efficace, car il favorise adhésion cellulaire à plusieurs substrats. Figure 5 a montre l’adhérence de cellules J774 à 0,5 µg/mL la fibronectine enduits puits en réponse à des milieux conditionnés prélevés antérieurement par le contrôle ou LPS traités les cellules endothéliales. Les images de champ lumineux et les mesures spectrophotométriques indiquent que les facteurs libérées dans les milieux conditionnés de l’endothélium LPS-traités sont suffisantes pour induire efficacement J774 activation, comme en témoigne l’induction de la fixation des cellules à fibronectine. Figure 5 b représente un essai d’adhérence Co pour évaluer la capacité de la couche vasculaire de soutenir les ferme adhésion leucocytaire par la nouvelle expression de molécules d’adhérence endothéliales. Brièvement, les cultures sont affamé de sérum des LTCE-04 les cellules stimulées par LPS pendant 6 h ont été lavés plusieurs fois et incubées conjointement avec la ligne de leucocyte que J774 précédemment marquée avec la sonde fluorescente, CFSE. Comme le montre les micrographies et mesures spectrofluorométrie, la stimulation LPS-vasculaire favorise l’interaction des cellules J774-CFSE à la monocouche endothéliale.
Figure 5 : rencontre avec les leucocytes monocouche endothéliale LPS-incubés par dosage de l’adhérence Co. (A) des images de microscopie photonique présentant une coloration violette en cristal des cellules J774 attachés aux puits de fibronectine enduite 0,5 µg/mL en réponse aux milieux conditionnés du contrôle ou du LPS-traités des cellules endothéliales. Echelle, 50 µm. L’analyse spectrophotométrique ci-dessous indique la mesure de l’absorbance exprimée en unités arbitraires (u.a.) ± SEM pour une expérience représentative en triple exemplaire. (B) Fluorescence micrographies montrent attachés cellules J774-CFSE au contrôle ou à cellules de LPS-traités LTCE-04 évaluées par des essais d’adhérence Co. Echelle = 50 µm. L’analyse fluorimétrique ci-dessous indique l’intensité de fluorescence, exprimée en unités arbitraires (u.a.) ± SEM pour une expérience représentative en triple exemplaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Objectif | NCBI RefSeq ID | Faire parvenir la séquence (5´-3´) | Inverse (5´-3´) |
| GAPDH | NM_001289726.1 | GTG LOI GAT GGC CCC TCT GG3 | TGA TDC TGC CCA CAG TDC TG |
| 36B4 | NM_007475.5 | AGA TGC AGC AGA STC GCA T | GTT CTT GCC CAT CAG ACC C |
| Cxcl10 | NM_021274.2 | AGC CAA ATC GCC TTT CAC T | CCC CTT CTT GGT GAG GAA TA |
| Ccl5 | NM_013653.3 | TCT CTG CAG CTG CCC TCA CC | TCT TGA ACC CCC TTC TTC TC |
| Cxcl1 | NM_008176.3 | GGG AAG AAA TGC AAG CTG AA | CTG TAC AGC AGG GTC CTT GAC |
| IL1R2 | NM_010555.4 | L’AGT GCA GCA AGA CCT TGG TAC CTA | L’AGT STC ACA GAC ATT TGC TCA CA |
| IL10 | NM_010548.2 | CTG GAC AAC ATA CTG LTC ACC G | GGG CAT CAC TTC TAC CAG GTA A |
| PECAM-1 | NM_008816.3 | CGA TGC GAT GGT GTA TAA CG | TGT CAC CCT CTT TTT GTC CAG |
| E-sélectine | NM_011345.2 | GCA TGT GGA ATG NOC AGA GA | GTC AGG GTG TTC CTG TGG TT |
| VCAM-1 | NM_011693.3 | GGC TGA ACA CTT TTC CCA GA | GCC ATT TGA GCA ATC GTT TT |
| ICAM-1 | NM_010493.3 | GCC LTC CCA TCA GCC TGT A | GGC GGC TCA GTA TCT CCT C |
Tableau 1 : Liste des amorces utilisées dans cette étude.
| Au repos | LPS | |||
| % | MFI | % | MFI | |
| Ctrl | 1,79 | 3.5 | 0.55 | 3.48 |
| PECAM-1 | 37,52 | 12.09 | 37,82 | 12.24 |
| E-sélectine | 17.12 | 8.06 | 88,13 | 49,84 |
| VCAM-1 | 53.08 | 20,51 | 99.30 | 204,05 |
| ICAM-1 | 99,76 | 114.81 | 99,82 | 363.89 |
Tableau 2 : les marqueurs de surface endothéliales dans l’inflammation induite par LPS. Quantification de l’expression de molécules adhérence de cellules sur les cellules au repos et stimulées par LPS de LTCE-04 par analyse en cytométrie en flux. Les valeurs représentatives pour chaque marqueur correspondant au pourcentage de cellules positives (%) et l’intensité de la fluorescence moyenne (IMF) dans les cellules endothéliales au repos et stimulées par LPS. PECAM-1 a été utilisé comme contrôle négatif dans ces conditions expérimentales.
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Discussion
Ce protocole endothélial décrit une technologie progressive qui établit les bases pour explorer de nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de la réponse inflammatoire. Ces approches reposent sur l’étude de l’activité endothéliale stimulée par LPS et évaluer les étapes critiques impliqués dans le recrutement des leucocytes au cours de la réaction inflammatoire, plus précisément : libération de cytokines endothéliale, adhérence endothélial molécules expression et leucocytes adhérence à la couche vasculaire. Une fois les paramètres endothéliales sont établis, le système peut chercher de nouveaux composés impliqués dans la régulation de la fonction endothéliale et, par conséquent, la progression inflammatoire. Ces médicaments réglementaires peuvent potentiellement être d’intérêt pour le marché pharmaceutique. La projection majeure du présent protocole séquentiel est de créer une Fondation pour l’extension de ces études à différents types d’endothéliales et conditions stimulantes en ajustant à leurs paramètres de l’activité vasculaire relative.
Médicaments retenus par cette projection constitueront des candidats intéressants pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les maladies inflammatoires. D’une part, les composés qui favorisent la réaction endothéliale et contribuent au recrutement des leucocytes sera prometteuses pour l’immunodéficience conditions16,17. En revanche, les inhibiteurs endothéliales constituerait un excellents thérapies pour les maladies inflammatoires chroniques10.
Caractérisation des cytokines exprimées par l’endothélium stimulée permet de prédire l’évolution de l’inflammation. Cytokines sont de petites protéines libérées par la couche endothéliale dans le contexte inflammatoire et fortement réglementer le comportement de leucocytes. Membres pro-inflammatoires, telles que Ccl5, Cxcl10 et Cxcl1, lier à leurs récepteurs spécifiques sur la surface des leucocytes et des signaux d’induire les interactions des leucocytes avec les molécules d’adhérence nouvellement exprimées sur la couche vasculaire (E-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1), et migration des leucocytes à la zone pathologique (Figure 1, Figure 2, , Figure 3)8,10,18. Autres membres d’une même famille de protéines sont impliquées dans la résolution de l’inflammation et, par conséquent, la réparation des tissus. L’expression de ces cytokines anti-inflammatoires s’applique pour les maladies inflammatoires chroniques parce qu’elles font obstacle au recrutement de leucocyte et favorisent l’immunité dégagement10,19,20. Pour sélectionner des régulateurs inflammatoires endothéliales possibles, il est recommandé d’effectuer cette analyse d’expression de cytokine et d’évaluer l’expression de molécules d’adhérence endothéliales en présence de composés d’intérêt. En fait, analyse les niveaux entre les anti-inflammatoires contre des cytokines pro-inflammatoires est utilisable comme une valeur prédictive pour la progression de la maladie et révèle la drogue d’intérêt thérapeutique,21.
Les LPS binding à ses déclencheurs de récepteur de surface cellulaire complexes cascades de signalisation intracellulaires, dirigés par MAP kinases ERK 1/2, JNK et p38 et le signalosome de NF-kB pour induire le programme transcriptionnel inflammatoire. Beaucoup de ces voies sont communs à d’autres stimuli inflammatoires telles que le TNF-α ou IL-110,22. L’activation endothéliale est déterminée en détectant la forme phosphorylée les membres de kinase de carte comme indiqué pour ERK 1/2 dans la Figure 4. En outre, l’activation endothéliale par LPS induit l’activité enzymatique de la IKKβ complexe, qui phosphoryle et dégrade l’inhibiteur de la NF-kB IκB complexe, permettant ainsi des membres d’effecteur de NF-kB de translocation nucléaire pour effectuer le correspondant activité transcriptionnelle (Figure 4). Caractériser les mécanismes par lesquels le médicament composé influence la réponse inflammatoire endothéliale est très utile, non seulement en décrivant la drogue, mais aussi en concevoir de nouveaux traitements inflammatoires en combinaison avec des thérapies conventionnelles compatibles 23.
Composés choisis parmi les tests de dépistage inflammatoire endothéliale, doit être approfondie afin de confirmer leur pertinence fonctionnelle dans les étapes critiques des tests de comportement de leucocyte, puisqu’en fin de compte, les cellules sont responsables par les troubles inflammatoires. Ces dosages analysent l’activité des leucocytes dans deux différents contextes expérimentaux. La première consiste à évaluer le rôle des cytokines endothéliales libérés lors de l’activation des leucocytes en adhésion intégrine-mediated dosages. Les intégrines de leucocytes sont activés par les cytokines libérées endothéliales. Capacité adhésive leucocyte de ligands de l’intégrine est donc une mesure représentative pour leukocyte function8,10,18. Le second est à étudier le rôle des molécules d’adhérence endothéliales nouvellement exprimées sur l’interaction de leucocytes à la couche vasculaire par des tests d’adhérence Co. Les molécules d’adhérence endothéliales exprimées dans le contexte inflammatoire est essentiel pour le recrutement des leucocytes aux tissus environnants. Ainsi, analyser les leucocytes interagissant avec la monocouche endothéliale imprégnées des cellules constitue une valeur pronostique pour la progression inflammatoire (Figure 5)8,10,18. Les résultats découlant de ces approches suggère que les composés sélectionnés sont des candidats sérieux dans la conception de stratégies futures pour le traitement des troubles inflammatoires
La proposition expérimentale définie ici est un outil polyvalent pour les applications futures en raison de sa capacité à extrapoler à différents systèmes cellulaires ou stimulants. La procédure peut être modifiée à l’endothélium d’origines différentes ou d’espèces et de tester ses fonctionnalités sur plusieurs cellules immunitaires, ainsi que différents agents inflammatoires tels que LPS, TNF-α, bactéries, virus, etc.. Comme décrit dans le texte, les chercheurs doivent caractériser tout d’abord l’activation endothéliale dans leur propre système pour ensuite caractériser le rôle d’un composé sélectionné sur la réponse inflammatoire. Limitations du protocole sont la sélection d’un contrôle négatif approprié et en définissant précisément les paramètres d’activité endothéliale qui discerner la mise au repos de l’État stimulée. Dans le cas où les conditions décrites dans le présent document ne fonctionnent pas pour un système différent, les chercheurs doivent dépanner les paramètres expérimentaux en effectuant des essais de dépendant du temps supplémentaires et en utilisant un gradient de concentration du stimulus inflammatoire pour définir une fenêtre de stimulateur qui permet de tester de nouveaux médicaments pour la régulation de la réponse inflammatoire.
Pour conclure, ce protocole inflammatoire endothélial est recommandé pour la recherche de nrégulateurs de la EW endothéliales ciblant la réponse inflammatoire. Cette procédure donnera roman, composés intéressants qui peut être appliquée à l’étude de ses futures applications et conception innovantes vasculaire spécifique thérapies contre les maladies inflammatoires liées, et qui pourrait potentiellement être de intérêt pour le marché pharmaceutique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) et l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (numéro de licence IERPY 1149/16 à L.A. ; 1410/09 MPY à S. Hortelano) ; par le MINECO via le Fondo de Investigación en Salud (FIS) (subventions numéros PI11.0036 et PI14.0055 de S. Hortelano). S. Herranz a été pris en charge par IERPY 1149/16 de ISCIII.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/mL |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/mL |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/mL |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/mL |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/mL |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/mL |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10,000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10,000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10,000 |
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