Visualisatie van het Axonal Projectiepatroon van Embryonische Motor Neuronen in<em> Drosophila</em
Summary
Dit werk bevat een standaard immunohistochemie methode om motorische neuron projecties van late-16 Drosophila melanogaster embryo's te visualiseren . De gefiltreerde bereiding van vaste embryo's die gekleurd zijn met FasII antilichaam, biedt een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motor axon pathfinding en target recognition tijdens neurale ontwikkeling te karakteriseren.
Abstract
De oprichting van functionele neuromusculaire circuits berust op nauwkeurige verbindingen tussen het ontwikkelen van motoraxonen en doelspieren. Motorneuronen verlenen groeikegels om langs specifieke wegen te navigeren door te reageren op een groot aantal axonbegeleidingstijlen die voortkomen uit de omliggende extracellulaire omgeving. Groeikegel target herkenning speelt ook een kritische rol in neuromusculaire specificiteit. Dit werk presenteert een standaard immunohistochemie protocol voor het visualiseren van motor neuron projecties van late stadium-16 Drosophila melanogaster embryo's. Dit protocol bevat een paar belangrijke stappen, waaronder een genotyping procedure, om de gewenste mutante embryo's te sorteren; Een immunostaining procedure, embryo's met fasciclin II (FasII) antilichaam op te nemen; En een dissectie procedure, om gefiltreerde preparaten van vaste embryo's te genereren. Motoraxonprojecties en spierpatronen in de periferie zijn veel beter zichtbaar in platte preparaten van gefiltreerde embryo's dan in whOle-mount embryo's. Daarom geeft de gefileerde bereiding van vaste embryo's, gekleurd met FasII-antilichaam, een krachtig instrument om de genen die nodig zijn voor motoraxon pathfinding en target recognition, te karakteriseren en kan ook toegepast worden op zowel de functionaliteit als de genetische schermen .
Introduction
Nauwkeurige en selectieve verbindingen tussen motoraxonen en doelspieren tijdens embryonale ontwikkeling zijn essentieel voor normale locomotie in Drosophila larven. Het embryonale patroon van 30 spiervezels in elk van de buikhemisegmenten A2-A7 wordt vastgesteld door stadium 16 1 . De 36 motorneuronen die worden gegenereerd in het ventrale zenuwkoord breiden hun axonen naar de periferie om specifieke doelspieren 2 te innervaten. Motor axon pathfinding en target herkenning kunnen worden visualiseerd door immunohistochemie met een antilichaam (muis monoklonaal antilichaam 1D4) 3 , 4 . Meerdere afbeeldingen van de motor axon projectie patronen in wildtype embryo's zijn beschikbaar op het web 5 . Het 1D4 antilichaam markeert alle motor axonen en drie longitudinale axon fascixen aan weerszijden van de middenlijn van het embryonale centrale zenuwstelsel (CNS) 4 </sUp> , 6 ( Figuur 1C en Figuur 2A ). Daarom biedt immunohistochemie met FasII antilichaam een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van genen die nodig zijn voor neuromusculaire connectiviteit voor het aantonen van de moleculaire mechanismen die onderliggend zijn aan motorische axonbegeleiding en doelherkenning.
In elk van de abdominale hemisegmenten A2-A7, motorisch axonenproject en selectief fascinerend in twee hoofdzenuwtakken, de segmentale zenuw (SN) en de intersegmentale zenuw (ISN) 2 , 4 en een kleine zenuwtak, de transversale zenuw (TN ) 7 . De SN selecteert selectief om twee zenuwtakken genaamd SNa en SNC te geven, terwijl de ISN splitst in drie zenuwtakken, de ISN, ISNb en ISNd 2 , 4 genoemd . Onder hen ISN, ISNb en SNa motor axonProjectiepatronen worden het meest nauwkeurig zichtbaar wanneer late stadium 16 embryo's met FasII antilichaam zijn gekleurd en gefileerd zijn ( Figuur 1C en Figuur 2A ). De ISN-motorische neuronen breiden hun axonen naar de innerlijke dorsale spieren 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 en 20 2 , 4 ( Figuur 2A ). De ISNb-motorneuronen innervieren de ventrolaterale spieren 6, 7, 12, 13, 14, 28 en 30 2 , 4 ( Figuur 2A en 2B). De SNa-zenuwtak probeert de laterale spieren 5, 8, 21, 22, 23 en 24 2 , 4 te innervaten ( Figuur 2A ). De TN, die bestaat uit twee motoraxonen, projecteert ipsilateraal langs de segmentale grens naar de innerlijke spier 25 en maakt synaptes met de laterale bipolaire dendritische neuron (LBD) in deOmtrek 7 ( figuur 2A ). Deze doelspierinervaties vereisen niet alleen selectieve defasciculatie van motoraxonen op specifieke keuzepunten, maar ook gericht op spierherkenning. Daarnaast zijn sommige vermoedelijke mesodermale geleidingspostcellen die als tussenliggende doelen fungeren, gevonden in zowel de ISN- als SNa-trajecten, maar niet langs de ISNb-weg 4 . Dit kan suggereren dat ISNb motor axon pathfinding op een duidelijke manier kan worden gereguleerd in vergelijking met ISN en SNa motor axon begeleiding. Het geeft ook aan dat perifere motor axon begeleiding een aantrekkelijk experimenteel model biedt om de differentiële of geconserveerde rollen van een enkele begeleiding cue te bestuderen Molecuul 8 .
Dit werk presenteert een standaard methode om de axonale projectiepatronen van embryonale motorische neuronen in Drosophila te visualiseren . De beschreven protocollen bevatten hoe u vaste embryo's kleurt met 1D4 aNtibody en verwerkt in 3,3'-diaminobenzidine (DAB) voor gefileerde preparaten. Een kritisch voordeel van de platte preparaten van vaste embryo's is de betere visualisatie van de axonale uitsteeksels en spierpatronen in de periferie. Verder laat dit werk ook zien hoe genotype vaste embryo's worden genotypeerd om de gewenste mutante embryo's te sorteren met behulp van de LacZ staining methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
De details van motorische axon geleidingsdefecten worden sneller en met betere nauwkeurigheid gescoord door de gefiltreerde bereiding van DAB-gekleurde embryo's dan door laserscanning van confocale microscopie van fluorescent gelabeld. Daarom is de gefiltreerde bereiding van vaste en 1D4-gekleurde embryo's het beste geschikt voor de functionele karakterisering van geleidingscue moleculen. Vier belangrijke klassen van begeleidende signalen, waaronder netrins, Slits, semaforen (Semas) en ephrins, en hun verwante r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik dank Alex L. Kolodkin, omdat ik dit gefileerde voorbereidingsprotocol in zijn laboratorium heb geleerd. Ik dank ook Young Gi Hong voor technische bijstand. Deze studie werd ondersteund door NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
Riferimenti
- Bate, M. The embryonic development of larval muscles in Drosophila. Development. 110 (3), 791-804 (1990).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67 (1), 45-57 (1991).
- Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).
- . Available from: https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html (2017)
- Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline. Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).
- Thor, S., Thomas, J. B. The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity. Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).
- Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila. Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).
- Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining. J. Vis. Exp. (34), (2009).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Kolodkin, A. L. Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo. Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).
- Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila. Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).
- Winberg, M. L. Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance. Cell. 95 (7), 903-916 (1998).
- Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila. Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).
- Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance. Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).
- Hartenstein, V. Stages of Embryonic Development. Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Kidd, T. Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors. Cell. 92 (2), 205-215 (1998).
- Pasterkamp, R. J. Getting neural circuits into shape with semaphorins. Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).
