胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em>ショウジョウバエ</em
Summary
この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。
Abstract
機能的な神経筋回路の確立は、運動軸索と標的筋肉の間の正確な接続に依存する。運動ニューロンは、周囲の細胞外環境から発する多数の軸索誘導手がかりに応答することによって、特定の経路に沿って移動する成長円錐を拡張する。成長円錐標的認識はまた、神経筋特異性において重要な役割を果たす。この研究は、後期段階16 ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学プロトコルを提示する。このプロトコールは、所望の突然変異胚を選別するための遺伝子型決定手順を含むいくつかの重要なステップを含む。ファシクリンII（FasII）抗体で胚にタグ付けするための免疫染色手順;固定された胚からフィレット調製物を生成するための解剖手順を含む。末梢のモーター軸索突起および筋肉パターンは、filleted embryosの平らな調製物では、whよりもはるかに良好に視覚化されるオレ – マウント胚。したがって、FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、モーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供し、機能喪失および機能獲得遺伝子スクリーンの両方に適用することもできる。
Introduction
ショウジョウバエの幼生における正常な運動のためには、胚発生の間に運動軸索と標的筋肉との間の正確で選択的な結合が不可欠である。腹部半分体A2〜A7の各々における30本の筋線維の胚形成は、段階16 1によって確立される。腹側神経脊髄で生成された36個の運動ニューロンは、軸索を末梢に伸ばして特定の標的筋肉を神経支配する2 。モーター軸索の経路探索および標的認識は、抗体（マウスモノクローナル抗体1D4） 3,4による免疫組織化学によって視覚化することができる。野生型胚のモーター軸索突起パターンの複数の画像がウェブ5上で利用可能である。 1D4抗体は、胚性中枢神経系（CNS） 4の正中線の両側にすべての運動軸索および3つの縦軸索束を標識する</sup> 、 6 （ 図1Cおよび図2A ）。したがって、FasII抗体による免疫組織化学は、運動軸索誘導および標的認識の根底にある分子メカニズムを実証するために、神経筋結合に必要な遺伝子を同定するための強力なツールを提供する。
腹部半分体A2~A7のそれぞれにおいて、運動軸索は、2つの主要な神経枝である分節神経（SN）および椎間板神経（ISN） 2,4 、および軽微な神経枝に選択的に束縛され、横断神経） 7 。 SNは選択的に脱皮して、SNaおよびSNcと呼ばれる2つの神経分枝を生じさせるが、ISNはISN、ISNbおよびISNdと呼ばれる3つの神経分枝に分裂する。その中でも、ISN、ISNb、およびSNaモーター軸索投射パターンは、後期ステージ16胚がFasII抗体で染色され、フィレット化されたときに最も正確に視覚化される（ 図1Cおよび図2A ）。 ISN運動ニューロンは、それらの軸索を背側筋肉1,2,3,4,9,10,11,18,19、および20,2,4（ 図2A ）に神経支配するように拡張する。 ISNb運動ニューロンは、腹外側筋6,7,12,13,14,28、および30,2,4（ 図2Aおよび2B）を支配する。 SNa神経枝は、側方筋肉5,8,21,22,23、および24,2,4（ 図2A ）を神経支配するように突出する。 2つの運動軸索からなるTNは、筋肉25を神経支配するための分節境界に沿って同側に突出しており、筋肉25の外側二極樹状突起ニューロン（LBD）とシナプスを形成する周辺部7 （ 図2A ）。これらの標的筋の神経支配は、特定の選択点において運動軸索の選択的脱毛皮化を必要とするだけでなく、筋肉の認識を標的とすることを必要とする。さらに、中間標的として作用するいくつかの推定中胚葉誘導ポスト細胞は、ISNおよびSNa経路の両方で見出されたが、ISNb経路4では見出されなかった。これは、ISNbモーター軸索経路探索が、ISNおよびSNaモーター軸索ガイダンスと比較して明確な様式で調節され得ることを示唆し、また、周辺モーター軸索ガイダンスが、単一のガイダンスキューの差異または保存された役割を研究する魅力的な実験モデル分子8 。
この研究は、ショウジョウバエの胚運動ニューロンの軸索突起パターンを視覚化するための標準的な方法を提示する。記載されたプロトコールは、1D4aで染色された固定胚を解剖する方法を含むフィブリル化調製物のために3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）で処理した。固定された胚の平らな調製物の1つの重大な利点は、周辺における軸索突起および筋肉パターンのより良好な視覚化である。さらに、この研究は、LacZ染色法を用いて所望の突然変異胚を選別するための固定された胚を遺伝子型決定する方法も示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
モーター軸索誘導欠陥の詳細は、蛍光標識されたもののレーザー走査共焦点顕微鏡によるよりも、DABで染色した胚のフィレット調製物により、より迅速かつより正確に得点される。したがって、固定された1D4染色胚のフィレット調製物は、誘導キュー分子の機能的特徴付けに最も適している。ネトリン、スリット、セマフォリン（セマ）、エフリンなどの4つの主要な手がかりとそれらの同族…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私はAlex L. Kolodkinに感謝します。私は彼の研究室でこのフィレット付きの準備プロトコルを学びました。私はまた、技術支援のために香港のYoung Giに感謝します。この研究はNRF-2013R1A1A4A01011329（SJ）によって支持された。
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
| 16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
| Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Agar | US Biological | A0930 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
| Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
| Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
| Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
| Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
| Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
| Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
| Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
| Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |
Riferimenti
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