Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans<em> Drosophila</em

Summary

Ce travail décrit une méthode d'immunohistochimie standard pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. La préparation en filets d'embryons fixés colorés à l'aide d'un anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes requis pour le suivi des axones motrices et la reconnaissance des cibles lors du développement neuronal.

Abstract

L'établissement de circuits neuromusculaires fonctionnels repose sur des liens précis entre le développement des axones moteurs et les muscles cibles. Les neurones moteurs étendent les cônes de croissance pour naviguer selon des voies spécifiques en répondant à un grand nombre de repères d'axones qui émanent de l'environnement extracellulaire environnant. La reconnaissance de la cible de cône de croissance joue également un rôle critique dans la spécificité neuromusculaire. Ce travail présente un protocole standard d'immunohistochimie pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. Ce protocole comprend quelques étapes clés, y compris une procédure de génotypage, pour trier les embryons mutants désirés; Une procédure d'immunocoloration, pour marquer les embryons avec un anticorps fasciclin II (FasII); Et une procédure de dissection, pour générer des préparations en filets à partir d'embryons fixes. Les projections d'axones moteurs et les modèles musculaires dans la périphérie sont mieux mieux visualisés dans des préparations plates d'embryons en filets que dans whEmbryons montés à l'huile. Par conséquent, la préparation en filets d'embryons fixés colorés avec de l'anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes nécessaires à la détection des axones et à la reconnaissance des cibles des axones, et peut également être appliqué à la fois aux écrans génétiques de perte de fonction et de gain de fonction .

Introduction

Des liaisons précises et sélectives entre les axones moteurs et les muscles cibles pendant le développement embryonnaire sont essentielles pour la locomotion normale dans les larves de Drosophila . Le modèle embryonnaire de 30 fibres musculaires dans chacun des hémisogravages abdominaux A2-A7 est établi par étape 16 ¹ . Les 36 neurones moteurs qui sont générés dans le cordon nerveux ventral étendent leurs axones à la périphérie pour inerver les muscles cibles spécifiques ² . L'identification par voie axonale motrice et la reconnaissance des cibles peuvent être visualisées par immunohistochimie avec un anticorps (anticorps monoclonal de souris 1D4) ^{3 , 4} . Des images multiples des modèles de projection d'axones moteurs dans des embryons de type sauvage sont disponibles sur le Web ⁵ . L'anticorps 1D4 marque tous les axones moteurs et trois fascicules axonaux longitudinaux de chaque côté de la ligne médiane du système nerveux central embryonnaire (SNC) ⁴ </sUp> ^{, 6} ( Figure 1C et Figure 2A ). Par conséquent, l'immunohistochimie avec l'anticorps FasII fournit un outil puissant pour identifier les gènes nécessaires à la connectivité neuromusculaire pour démontrer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la direction de l'axone moteur et à la reconnaissance des cibles.

Dans chacun des hémisogravages abdominaux A2-A7, les axones moteurs se projettent et sélectivement fasciculent en deux branches nerveuses principales, le nerf segmentaire (SN) et le nerf intersegmentaire (ISN) ^{2 , 4} et une branche nerveuse mineure, le nerf transversal (TN ) ⁷ . Le SN sélectivement défascecte pour donner naissance à deux branches nerveuses appelées SNa et SNc, alors que l'ISN se divise en trois branches nerveuses appelées ISN, ISNb et ISNd ^{2 , 4} . Parmi eux, l'axon moteur ISN, ISNb et SNaLes profils de projection sont visualisés avec précision lorsque les embryons de phase 16 sont colorés avec des anticorps FasII et sont filetés ( Figure 1C et Figure 2A ). Les neurones moteurs ISN étendent leurs axones pour innerver les muscles dorsaux 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 et 20 ^{2 , 4} ( figure 2A ). Les neurones moteurs ISNb inervent les muscles ventrolatéraux 6, 7, 12, 13, 14, 28 et 30 ^{2 , 4} ( Figure 2A et 2B). La branche nerveuse SNa projette d'innerver les muscles latéraux 5, 8, 21, 22, 23 et 24 ^{2 , 4} ( figure 2A ). Le TN, qui se compose de deux axones moteurs, projette de manière ipsilatéralement le long de la bordure segmentaire pour innerver le muscle 25 et fait des synapses avec le neurone dendritique bipolaire latéral (LBD)Périphérie ⁷ ( figure 2A ). Ces insuffisances musculaires cibles exigent non seulement la défascication sélective des axones moteurs à des points de choix spécifiques, mais aussi la reconnaissance musculaire cible. De plus, certaines cellules putatives de piste de guidage mésodermiques qui agissent comme des cibles intermédiaires ont été trouvées dans les voies ISN et SNa, mais pas le long de la voie ISNb ⁴ . Cela pourrait suggérer que le guidage de l'axone du moteur ISNb peut être réglé de manière distincte par rapport au guidage de l'axone du moteur ISN et SNa, et indique également que le guidage axonal du moteur périphérique fournit un modèle expérimental attrayant pour étudier les rôles différentiels ou conservés d'un seul guidage Molécule ⁸ .

Ce travail présente une méthode standard pour visualiser les modèles de projection axonale des neurones moteurs embryonnaires dans Drosophila . Les protocoles décrits incluent la façon de disséquer des embryons fixés colorés avec 1D4 aNtibody et traité en 3,3'-diaminobenzidine (DAB) pour les préparations en filets. Un avantage critique des préparations plates d'embryons fixes est la meilleure visualisation des projections axonales et des modèles musculaires dans la périphérie. En outre, ce travail montre également comment génotyper des embryons fixes pour trier les embryons mutants souhaités en utilisant la méthode de coloration LacZ.

Protocol

1. Préparation Préparer 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec une solution de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (PBT) en ajoutant 0,5 g de sérumalbumine bovine (BSA) et 0,5 ml de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (voir la Table des matières) à 500 ml de PBS 1X Et en remuant pendant au moins 30 minutes. Conserver à 4 ° C. Utiliser quand il s'agit relativement frais et conserver la solution dans une bouteille propre. Faire 10 ml de paraformaldéhyde à 4% en ajoutan…

Representative Results

Les connexions précises entre les axones moteurs et les muscles cibles pendant le développement neuronal dépendent de la répulsion axon-axonique sélective et de la reconnaissance de cible à des points de choix spécifiques 4 . Chez Drosophila , la répulsion sélective entre les axones moteurs est en partie régie par l'action combinée des semaphorines de classe 1 et 2 (Semas), y compris Sema-1a, Sema-2a et Sema-2b 8 <su…

Discussion

Les détails des défauts de guidage de l'axone motrice sont évalués plus rapidement et avec une meilleure précision par la préparation en filets d'embryons colorés au DAB que par microscopie confocale à balayage laser d'étiquettes fluorescentes. Par conséquent, la préparation en filets d'embryons fixés et colorés au 1D4 convient le mieux à la caractérisation fonctionnelle des molécules de guidage. Quatre grandes classes de repères d'orientation, y compris les netrins, les fentes, les …

Materials

Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)