Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling
Summary
Ein modularer Ansatz für die Synthese von N– Glykanen zur Befestigung an einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas schieben (ACG Folie) wie ein Glycan Microarray entwickelt wurde und seine Verwendung für die Profilerstellung für eine HIV weitgehend neutralisierende Antikörper nachgewiesen.
Abstract
Wir präsentieren Ihnen eine hocheffiziente Weise für die schnelle Zubereitung einer breiten Palette von N-verknüpft Oligosaccharide (schätzungsweise um 20.000 Strukturen zu überschreiten), die auf menschlichen Glykoproteinen weit verbreitet sind. Um die gewünschte strukturelle Vielfalt zu erreichen, begann die Strategie mit der Chemo-enzymatische Synthese der drei Arten von Oligosaccharyl Fluorid Module, gefolgt von ihrer schrittweisen α-selektive Glykosylierungen an der 3-O und 6-O der Positionen der Mannose-Reste von den gemeinsamen Kern Trisaccharide haben eine entscheidende β-Mannoside-Verbindung. Anbei zeigen wir weitere N– Glykane auf die Oberfläche einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas (ACG) Folie erstellen Sie eine kovalente gemischte Anordnung für die Analyse von Hetero-Ligand Interaktion mit einem HIV-Antikörper. Geben Sie insbesondere das Bindungsverhalten von ein neu isolierte HIV-1 im großen und ganzen neutralisierende Antikörper (bNAb), PG9, zur Mischung von eng beieinander liegenden Mann5GlcNAc2 (Mensch5) und 2,6-di-Sialylated Bi-antennary N– Glycan (SCT ) auf eine ACG-Array, öffnet sich einen neuen Weg um das effektive Immunogen Design für HIV-Impfstoff-Entwicklung führen. Darüber hinaus verkörpert unsere ACG-Array ein mächtiges Werkzeug um andere HIV-Antikörper für Hetero-Liganden Bindungsverhalten zu studieren.
Introduction
N– Glykane auf Glykoproteine sind kovalent das Asparagin verbunden (Asn) Rückstände von den Konsens Asn-Xxx-Ser/Thr Sequon betreffen mehrere biologische Prozesse wie Protein-Konformation, Antigenität, Löslichkeit und Lektin-Anerkennung 1 , 2. die chemische Synthese von N-verknüpften Oligosacchariden repräsentiert eine synthetische Herausforderung wegen ihrer großen strukturellen Mikro Heterogenität und stark verzweigte Architektur. Sorgfältige Auswahl des Schutzes Gruppen Tune Reaktivität der Bausteine, Selektivität in Anomeric Zentren und ordnungsgemäße Verwendung der Projektträger zu erreichen / Activator(s) sind Schlüsselelemente in der Synthese von komplexen Oligosaccharide. Um diese Komplexität zu lösen, wurde eine große Menge an Arbeit, N– Glycan Synthese voraus berichtet vor kurzem3,4. Trotz dieser robusten Ansätze finden eine effektive Methode für die Herstellung einer breiten Palette von N– Glykanen (~ 20.000) bleibt eine große Herausforderung.
Die schnellen Mutationsrate von HIV-1, die umfangreiche genetische Vielfalt und seine Fähigkeit zur Flucht aus neutralisierende Antikörper-Reaktion, zu erreichen ist eine der größten Herausforderungen zu entwickeln, einen sicheren und prophylaktischen Impfstoff gegen HIV-1-5,6 , 7. eine wirksame Taktik, die HIV verwendet, um die Host-Immunantwort zu vermeiden ist die post-translationalen Glykosylierung der Umschlag Glykoprotein gp120 mit einem vielfältigen N-Glykane abgeleitet vom Host Glykosylierung Maschinen8, verbunden 9. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht über die genaue Analyse von rekombinanten Monomeren HIV-1 gp120 Glykosylierung von menschlichen embryonalen (HEK) 293T Nierenzellen schlägt das Auftreten von strukturellen Microheterogeneity mit einer charakteristischen zellspezifische Muster10 , 11 , 12. daher die Glycan Besonderheiten der HIV-1-bNAbs erfordert gut charakterisierten gp120 Verständnis im Zusammenhang mit N– Glycan Strukturen in einer Menge, die ausreicht für die Analyse.
Die Entdeckung von Glycan-Microarray-Technologie zur Verfügung gestellt hohe Durchsatz-basierte Exploration Besonderheiten der unterschiedlichsten Kohlenhydrat-bindende Proteine, Viren/Bakterien Adhesins, Giftstoffe, Antikörper und Lectines13,14 . Die systematische Glykane Anordnung in einem angeordneten Chip-basierten Format könnte problematisch geringe Affinität Protein-Glycan Interaktionen durch multivalente Präsentation15,16,17,18bestimmen. Diese Chip-basierte Glycan Anordnung scheint bequem effektiv Zell-Zell-Schnittstellen zu imitieren. Um die Technologie zu bereichern und überwinden die ungleichmäßige Problem mit herkömmlichen Array Formate, entwickelt unsere Gruppe vor kurzem eine Glycan-Array auf eine Aluminiumoxid-beschichtete Glas (ACG) Folie mit phosphonic Acid-ended Glykoproteinen, um die Signalstärke zu verbessern, Homogenität und Empfindlichkeit19,20.
Um den Stand der Erkenntnisse über Glycan Epitope neu isolierte HIV-1 breit neutralisierenden Antikörpern (bNAbs) zu verbessern, haben wir eine hocheffiziente modulare Strategie für die Herstellung einer breiten Palette von N-Glykanen21 verbunden ,22 Drucken auf eine ACG schieben (siehe Abbildung 1). Spezifität Profile Studien von HIV-1-bNAbs auf eine ACG-Reihe angeboten, dass die ungewöhnliche Erkennung von Hetero-Glycan Bindungsverhalten von hochpotenten bNAb PG9, die von HIV isoliert wurde Personen23,24,25infiziert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine Klasse von HIV-1-bNAbs einschließlich PG9, PG16 und PGMs 128 141-145 wurden berichtet, hochwirksame bei der Neutralisierung von 70-80 % der zirkulierenden HIV-1-Isolate. Die Epitope von diesen bNAbs sind unter den Varianten der gesamten HIV-1 Gruppe M hoch konserviert, deshalb können sie leiten die effektive Immunogen Gestaltung eines HIV-Impfstoffs neutralisierende Antikörper23,24,25 zu entlocken . Als Teil unserer Bem?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Thin Film Technology Division, Instrument Technology Research Center (ITRC) und nationalen angewendet Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Council (keine zu gewähren. Die meisten 105-0210-01-13-01) und Academia Sinica.
Materials
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
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