Модульный подход к синтезу N– гликанов для крепления к оксида алюминия покрытием стекла слайд (ACG слайд) как glycan microarray был разработан и его использование для профилирования широко нейтрализующих антител ВИЧ была продемонстрирована.
Мы представляем очень эффективный способ для быстрой подготовки широкого круга N-связанных олигосахариды (по оценкам превышает 20 000 структур), которые обычно встречаются на человеческих гликопротеинов. Для достижения желаемого структурного разнообразия, стратегии началось с химио ферментативный синтез трех видов oligosaccharyl фторид модулей, следуют их поэтапного α-селективного glycosylations на 3-O -6O позиции манноза остатки общих основных трисахариды, имеющие решающее значение β-mannoside связь. Далее мы придает N– гликанов поверхности оксида алюминия покрытием стекла (ACG) слайд для создания ковалентных смешанные массива для анализа взаимодействия гетеро лиганда с антитела ВИЧ. В частности поведение привязки вновь изолированных ВИЧ-1 широко нейтрализующих антител (bNAb), PG9, смесь близко расположенными человек5GlcNAc2 (5человек) и 2,6-ди sialylated Би antennary комплекс типа N– glycan (SCT ) на массив ACG, открывает новые возможности для руководства эффективным immunogen дизайн для разработки вакцины против ВИЧ. Кроме того наш массив ACG воплощает в себе мощный инструмент для изучения других антител на ВИЧ для привязки гетеро лиганд.
N– гликанов на гликопротеинов ковалентно связаны с аспарагин (Asn) остатки Asn-Xxx-Ser/Чет sequon консенсуса, которые затрагивают несколько биологических процессов, как белка конформации, антигенностью, растворимость и Лектин признание 1 , 2. Химический синтез N-связанных олигосахариды представляет собой значительный вызов синтетических из-за их огромные структурной неоднородности микро и весьма разветвленной архитектуры. Тщательный отбор защиты групп для настройки реактивности строительных блоков, достижения селективности в anomeric центрах и надлежащего использования промоутер / activator(s) являются ключевыми элементами в синтезе сложных олигосахариды. Для решения этой проблемы сложности, большой объем работы для продвижения N– glycan синтез сообщалось недавно3,4. Несмотря на эти надежные подходы находить эффективный метод для подготовки широкого круга N– гликанов (~ 20000) остается основной задачей.
Быстрой мутации ВИЧ-1 для достижения обширные генетического разнообразия и его способность бежать от нейтрализации реакции антитела, составляет среди наиболее серьезных проблем для разработки безопасных и профилактической вакцины против ВИЧ-15,6 , 7. одна эффективная тактика, что ВИЧ использует, чтобы избежать иммунного ответа является столб-поступательные гликозилирования оболочки gp120 гликопротеин с разнообразной N-связаны гликаны, производные от принимающей гликозилирования машины8, 9. Недавний доклад относительно точный анализ рекомбинатных мономерных гликозилирования gp120 ВИЧ-1 от 293T клеток человеческого эмбриона почек (ГЭС) предполагает возникновение структурных микрогетерогенности с характерным клеток конкретных шаблон10 , 11 , 12. Таким образом, понимание специфики glycan ВИЧ-1 bNAbs требует хорошо характеризуется gp120 связанных с N– glycan структур в количестве, достаточном для анализа.
Открытие технологии microarray glycan условии высокой пропускной способности на основе изучение особенности широкий спектр углеводов связывающих белков, вирусы/бактериальных адгезины, токсинов, антител и lectines13,14 . Организация систематического гликанов в формате выстроились на основе чипа может определить проблематичным низкого сродства белка glycan взаимодействия через многовалентных презентация15,16,17,18. Этот механизм на основе чипа glycan удобно, как представляется, эффективно имитировать интерфейсы ячеек. Чтобы обогатить технологии и преодоления неравномерным проблема, связанная с обычными массив форматов, наша группа недавно разработали glycan массив на слайде оксида алюминия покрытием стекла (ACG), с помощью фосфоновая кислота закончился гликанов для повышения интенсивности сигнала, однородность и чувствительность19,20.
Для улучшения нынешнего понимания о glycan epitopes вновь изолированных ВИЧ-1 широко нейтрализующих антител (bNAbs), мы разработали стратегию высокоэффективная модульная для подготовки широкого спектра N-связаны гликанов21 ,22 быть напечатаны на ACG слайд (см. Рисунок 1). Специфика профилирования исследования ВИЧ-1 bNAbs на массив АКГ предложили необычные обнаружения гетеро glycan поведение привязки сильнодействующим bNAb PG9, который был изолирован от ВИЧ инфицированных лиц23,24,25.
Класс bNAbs ВИЧ-1, включая PG9, PG16 и PGTs 128, 141-145 были сообщается сильнодействующим в нейтрализации 70-80% циркулирующих изолятов ВИЧ-1. Среди вариантов всей группы ВИЧ-1 M высоко сохраняются epitopes этих bNAbs, поэтому они могут вести эффективную immunogen дизайн для вакцины против ВИЧ для получения нейтрал?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят тонких разделения фильме технологии, инструмент технологии исследовательский центр (ITRC) и национальных применяется научно-исследовательских лабораторий, парк науки Синьчжу, Тайвань. Эта работа была поддержана национального научного Совета (Грант нет. Большинство 105-0210-01-13-01) и Синика.
Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
Clean glass slide | Schott | ||
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |