Patronen van bioactieve eiwitten of peptiden op Hydrogel Fotochemie voor biologische toepassingen gebruiken
Summary
Bij deze methode, wij gebruiken photopolymerization en klik op chemie technieken proteïne of peptide om patronen te creëren op het oppervlak van polyethyleenglycol (PEG) hydrogels, verstrekken geïmmobiliseerd bioactieve signalen voor de studie van cellulaire reacties in vitro .
Abstract
Er zijn vele biologische stimuli die gedrag en cel van de stam van celdifferentiatie beïnvloeden kunnen. Benaderingen van de cultuur van de algemene cel, is afhankelijk van oplosbare factoren binnen de middellange tot controle cel gedrag. Echter oplosbaar toevoegingen kunnen niet na te bootsen bepaalde signalering van motieven, zoals matrix-gebonden groeifactoren, cel-cel signalering en ruimtelijke biochemische signalen, die gemeenschappelijke invloeden op de cellen. Bovendien, biofysische eigenschappen van de matrix, zoals substraat stijfheid, spelen een belangrijke rol in het lot van de cel, die is niet gemakkelijk gemanipuleerd met behulp van conventionele cel culturing praktijken. In deze methode beschrijven we een eenvoudig protocol om gedessineerde bioactieve eiwitten op synthetische polyethyleenglycol (PEG) hydrogels Fotochemie gebruiken. Dit platform zorgt voor de onafhankelijke controle van substraat stijfheid en ruimtelijke biochemische signalen. Deze hydrogels kunnen een groot aantal fysiologisch relevante stijfheid waarden bereiken. Bovendien, kunnen het oppervlak van deze hydrogels photopatterned met bioactieve peptiden of eiwitten via thiol-een klik op scheikunde reacties. Deze methoden zijn geoptimaliseerd om te behouden van eiwitfunctie na oppervlakte immobilisatie. Dit is een veelzijdige protocol dat kan worden toegepast op elke proteïne of peptide van belang zijn voor het maken van een verscheidenheid aan patronen. Ten slotte kunnen cellen uitgezaaid op het oppervlak van deze bioactieve hydrogels na verloop van tijd worden gecontroleerd als ze op ruimtelijk specifieke signalen reageren.
Introduction
Er zijn vele prikkels die cel gedrag beïnvloedt. In het algemeen, typische cel kweken technieken afhankelijk van oplosbare factoren te ontlokken cellulaire reacties; Er zijn echter beperkingen aan deze benadering. Deze methoden zijn niet juist weergegeven in alle signalering motieven voorkomende in vivo. Dergelijke signalering mechanismen zijn afgezonderd groeifactoren, cel-cel signalering en ruimtelijk-specifieke biochemische signalen. Bovendien, substraat stijfheid kan spelen een belangrijke rol in gedrag en cel van de stam van celdifferentiatie en is niet gemakkelijk gemanipuleerd met behulp van gemeenschappelijke cel kweken praktijken1,2. Biomaterial benaderingen bieden een nieuw platform om te beginnen met het verkennen van deze signalering mechanismen. In het bijzonder, zijn hydrogels uitstekende kandidaten voor het afstemmen van substraat stijfheid3,4, immobilizing eiwitten en peptiden5,6, en creëren van ruimtelijk specifieke patronen7, 8.
Hydrogels worden vaak gebruikt als steigers in weefselengineering vanwege hun biofysische en biochemische raakvlakken met de extracellulaire matrix (ECM)9,10. Natuurlijke polymeren zijn gemeenschappelijke keuzen voor steigers, zoals ze biocompatibel zijn en zich in vele weefsels van het lichaam bevinden. De beperking van het gebruik van natuurlijke polymeren als substraten is dat zij niet gemakkelijk gemanipuleerd chemische wordt voor bioconjugation. Aan de andere kant, zijn synthetische hydrogels, zo zoals PEG, uitstekende platforms voor gerichte oplossingen11,12. Bovendien, PEG hydrogels niet doen uitlokken een cellulaire reactie en daarom als inerte backbones voor het maken van bioactieve steigers worden gebruikt.
To create bioactieve hydrogels, click zowel photopolymerization als thiol-een scheikunde reacties werkzaam zijn. Deze photoreactions vereisen een photoinitiator en een UV-lichtbron. Wanneer photoinitiators worden ingevoerd voor UV-licht, breken obligaties aan formulier radicalen. Scripties radicalen zijn nodig voor het initiëren van de reactie maar kunnen een negatieve invloed hebben op eiwit topicale12,13. Daarom is het cruciaal om photoinitiator en UV blootstelling tijden om eiwit topicale te optimaliseren.
Bij deze methode worden de hydrogels gesynthetiseerd door acrylaat-acrylaat keten groei photopolymerization. PEG-diacrylate (PEGDA) monomeren reageren met elkaar om te vormen van vertakte polymeer netwerken die verantwoordelijk zijn voor de structuur van de hydrogel. De concentratie van PEGDA monomeren binnen de gel voorloper oplossing zullen beheersen de stijfheid van het substraat. Als gevolg van de kleine porie grootte de hydrogel, ECM eiwitten zoals fibronectine kunnen gemakkelijk worden opgenomen binnen de hydrogel ten behoeve van de bijlage van de cel. Ten slotte, deze hydrogels kan oppervlak-patroon met bioactieve peptiden of eiwitten via thiol-een klik op scheikunde reacties. Hier, zal spoorverontreiniging gratis acrylaten binnen de hydrogel systeem reageren met gratis thiolen gelegen op de proteïne of peptide wanneer blootgesteld aan UV-licht. Nadat de proteïnen of de peptiden zijn geïmmobiliseerd op het oppervlak van de hydrogel, kan de hydrogel worden achtergelaten bij 4 ° C voor enkele weken zonder verlies van topicale. Dit biedt gemak, flexibele experimentele planning en de mogelijkheid voor samenwerking tussen laboratoria. Globaal, dit platform biedt biomechanische en ruimtelijke biochemische controle, onafhankelijk van elkaar, voor de gelegenheid om de cellulaire gedrag beïnvloedt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een methode voor het maken van bioactieve eiwitten patronen voor biologische toepassingen. Er zijn verschillende wijzigingen die kunnen worden gemaakt om te passen dit protocol voor verschillende experimenten. Ten eerste hangt cel koppelingseisen voor verschillende soorten cellen. Als arme cel gehechtheid aan de gels in eerste instantie wordt waargenomen, wordt verhoging van de concentratie van het ECM-eiwit binnen de voorloper oplossing geadviseerd. Andere ECM-eiwitten kunnen worden gebruikt in plaats…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd vooral gesteund door subsidies van de American Heart Association wetenschapper ontwikkeling Grant (12SDG12050083 naar G.D.), de National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 tot G.D.) en de National Science Foundation (CBET-1263455 en CBET-1350240 naar G.D.).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
Riferimenti
- Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
- Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
- Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
- Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
- Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
- Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
- McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
- Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
- Truat’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/…/MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017)
- Ellman’s Reagent Instructions. Thermo Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017)
- Desalting Columns. GE Life Sciences Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017)
