Musterung bioaktive Proteine oder Peptide auf Hydrogel mit Photochemie für biologische Anwendungen
Summary
Bei dieser Methode verwenden wir Photopolymerisation und klicken Sie auf Chemie Techniken zum Erstellen von Protein oder Peptid Mustern auf der Oberfläche von Polyethylenglykol (PEG) Hydrogele, Bereitstellung immobilisiert bioaktiven Signale für die Erforschung der zellulären Reaktionen in-vitro- .
Abstract
Es gibt viele biologische Reize, die Zelldifferenzierung Verhalten und Stammzellforschung beeinflussen können. Allgemeine Zelle Kultur Ansätze setzen auf lösliche Faktoren innerhalb des Mediums zu Zelle Regelverhalten. Jedoch können nicht lösliche Zusätze imitieren bestimmte Signal-Motive, wie Matrix-gebundenen Wachstumsfaktoren, Zell-Zell-Signalisierung und räumliche biochemische Cues, die gemeinsamen Einflüsse auf die Zellen sind. Des weiteren Biophysikalische Eigenschaften der Matrix wie Substrat Steifigkeit, eine wichtige Rolle an das Schicksal der Zelle, die mit konventionellen Zelle Kultivierung Praktiken nicht leicht manipuliert werden. Bei dieser Methode beschreiben wir ein einfache Protokoll um gemusterte bioaktive Proteine auf synthetische Polyethylenglykol (PEG) Hydrogele mit Photochemie. Diese Plattform ermöglicht die unabhängige Kontrolle der Substrat-Steifigkeit und räumliche biochemische Cues. Diese Hydrogele erreichen eine große Auswahl an physiologisch relevanten Steifigkeitswerte. Darüber hinaus können die Oberflächen der diese Hydrogele Photopatterned mit bioaktiven Peptiden oder Proteine über Thiol-ene klicken Sie Chemie Reaktionen. Diese Methoden wurden optimiert, um die Proteinfunktion nach Oberfläche Immobilisierung zu behalten. Dies ist ein vielseitiges Protokoll, die Protein oder Peptid von Interesse für eine Vielzahl von Mustern erstellen angewendet werden kann. Schließlich können Zellen ausgesät auf die Oberflächen der diese bioaktiven Hydrogele im Laufe der Zeit überwacht werden, da sie auf räumlich bestimmte Signale zu reagieren.
Introduction
Es gibt viele Reize, die Zelle Verhalten beeinflussen. Im Allgemeinen setzen typische Zelle Kultivierung Techniken auf lösliche Faktoren, die zelluläre Reaktionen hervorrufen; Es gibt jedoch Einschränkungen dieses Ansatzes. Diese Methoden sind nicht in der Lage, alle Signalisierung Motive häufig korrekt anzuzeigen in-vivo. Diese Signalisierung Mechanismen umfassen abgesonderten Wachstumsfaktoren, Zell-Zell-Signalisierung und räumlich-spezifische biochemische Signale. Darüber hinaus Substrat Steifigkeit kann eine wichtige Rolle im Verhalten und Stammzellforschung Zelldifferenzierung und ist nicht leicht zu manipulieren mit gemeinsamen Zelle Kultivierung Praktiken1,2. Biomaterial Ansätze bieten eine neue Plattform, um diese Signalisierung Mechanismen erforschen anzufangen. Vor allem sind Hydrogele ausgezeichnete Kandidaten für tuning Substrat Steifigkeit3,4, Immobilisierung Proteine und Peptide5,6, und erstellen räumlich bestimmten Mustern7, 8.
Hydrogele sind allgemein als Gerüste in Gewebetechnik aufgrund ihrer biophysikalischen und biochemischen Gemeinsamkeiten mit der extrazellulären Matrix (ECM)9,10verwendet. Natürliche Polymere sind gemeinsame Entscheidungen für Gerüste, wie sie biokompatibel sind und werden in vielen Geweben des Körpers gefunden. Die Beschränkung der Verwendung von natürlichen Polymeren als Substrate ist, dass sie leicht zu manipulieren chemische Moieties für Biokonjugaten fehlt. Auf der anderen Seite sind synthetische Hydrogele als solche wie PEG, hervorragende Plattformen für gezielte Chemikalien11,12. Darüber hinaus PEG Hydrogele keine zelluläre Reaktion hervorrufen und dienen daher als inerte Backbones für bioaktive Scaffolds erstellen.
Klicken Sie zum Erstellen von bioaktiven Hydrogele Photopolymerisation und Thiol-ene auf Chemie Reaktionen eingesetzt werden. Diese Lichtreaktionen erfordern einen Photoinitiator und eine UV-Lichtquelle. Bei der Einführung von Photoinitiatoren mit UV-Licht brechen Anleihen zu bilden Radikale. Radikale Thesen sind notwendig für die Initiierung der Reaktions aber Protein Bioaktivität12,13negativ beeinflussen können. Daher ist es entscheidend, Photoinitiator und UV Belichtungszeiten Protein Bioaktivität weiterhin zu optimieren.
Bei dieser Methode werden Hydrogele durch Acrylat-Acrylat Kette Wachstum Photopolymerisation synthetisiert. PEG-Diacrylate (PEGDA) Monomeren reagieren miteinander und bilden verzweigte Polymere Netzwerke verantwortlich für die Struktur der Hydrogel. Die Konzentration der PEGDA Monomere in der Gel-Vorläufer-Lösung steuert die Substrat-Steifigkeit. Aufgrund der geringen Porengröße von Hydrogel, ECM Proteine wie Fibronektin innerhalb der Hydrogel zum Zwecke der Zellhaftung leicht eingebaut werden können. Zu guter Letzt kann diese Hydrogele Oberfläche gemustert mit bioaktiven Peptide oder Proteine über Thiol-ene klicken Sie Chemie Reaktionen. Hier reagiert nicht umgesetzte kostenlose Acrylaten innerhalb des Systems der Hydrogel mit kostenlose Thiole befindet sich auf dem Protein oder Peptid bei UV-Licht ausgesetzt. Nachdem die Proteine oder Peptide auf der Hydrogel-Oberfläche immobilisiert sind, kann das Hydrogel bei 4 ° C für mehrere Wochen gespeichert werden ohne Bioaktivität. Dies bietet Bequemlichkeit, flexible experimentelle Planung und die Möglichkeit für eine Zusammenarbeit zwischen Labors. Insgesamt ermöglicht diese Plattform für biomechanische und räumliche biochemische Kontrolle, unabhängig voneinander, für die Gelegenheit, zelluläre Verhalten beeinflussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine Methode zum Erstellen von bioaktiven Proteinmuster für biologische Anwendungen. Es gibt einige Änderungen, die Anpassung dieses Protokoll für verschiedene Experimente gemacht werden können. Erstens variieren die Zelle Anschaltebedingungen für verschiedene Zelltypen. Wenn Arme Zelle Anhaftung an die Gele zunächst beobachtet wird, ist es ratsam, Erhöhung der Konzentration des ECM-Proteins innerhalb der Vorläufer-Lösung. Anderen ECM-Proteine können anstelle von Fibronektin, darunter ve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vor allem unterstützt durch Zuschüsse aus der American Heart Association Wissenschaftler Development Grant (12SDG12050083, G.D), die National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245, G.D) und der National Science Foundation (CBET-1263455 und CBET-1350240, G.D).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
Riferimenti
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