Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche
Summary
In questo metodo, usiamo fotopolimerizzazione e tecniche di chimica clicca per creare modelli di proteina o peptide sulla superficie di idrogeli di polietilenglicole (PEG), fornendo immobilizzata bioattivi segnali per lo studio delle risposte cellulari in vitro .
Abstract
Ci sono molti stimoli biologici che possono influenzare la differenziazione delle cellule staminali e comportamento delle cellule. Cellulari generali cultura approcci si basano su fattori solubili all’interno del mezzo per controllare il comportamento delle cellule. Tuttavia, aggiunte solubile non possono simulare alcuni motivi, come fattori di crescita associati a matrice di segnalazione, segnalazione della cellula-cellula e spaziale segnali biochimici, che sono comuni influenze sulle cellule. Inoltre, le proprietà biofisiche della matrice, come ad esempio la rigidità del substrato, svolgono i ruoli importanti nel destino della cellula, che non è facilmente manipolata utilizzando pratiche di coltura convenzionale della cella. In questo metodo, descriviamo un protocollo semplice per fornire proteine bioattive modellati su idrogel sintetico in polietilene glicole (spina) utilizzando fotochimica. Questa piattaforma permette il controllo indipendente della rigidità del substrato e spaziale segnali biochimici. Questi idrogeli possono realizzare una vasta gamma di valori di rigidità fisiologicamente rilevanti. Inoltre, le superfici di questi idrogeli possono essere photopatterned con peptidi bioattivi o proteine via tiolo-ene clicca chimica reazioni. Questi metodi sono stati ottimizzati per conservare la funzione della proteina dopo immobilizzazione superficiale. Si tratta di un protocollo versatile che può essere applicato a qualsiasi proteina o peptide di interesse per creare una varietà di modelli. Infine, cellule seminate sulle superfici di questi idrogeli bioattivi possono essere monitorate nel tempo come rispondono ai segnali nello spazio specifici.
Introduction
Ci sono molti stimoli che influenzano il comportamento delle cellule. In generale, tecniche di coltura tipica cellula si basano su fattori solubili di suscitare risposte cellulari; Tuttavia, ci sono limitazioni di questo approccio. Questi metodi sono in grado di visualizzare con precisione tutti i motivi di segnalazione comunemente trovati in vivo. Tali meccanismi di segnalazione includono sequestrati fattori di crescita, segnalazione della cellula-cellula e spazialmente specifici segnali biochimici. Inoltre, rigidità del substrato può giocare un ruolo importante nel differenziamento delle cellule staminali e comportamento cellulare e non è facilmente manipolata utilizzando comuni pratiche coltura cellulare1,2. Biomateriale approcci offrono una nuova piattaforma per cominciare ad esplorare questi meccanismi di segnalazione. In particolare, idrogeli sono candidati eccellenti per ottimizzazione substrato rigidità3,4, immobilizzante proteine e peptidi5,6e la creazione di modelli spazialmente specifici7, 8.
Idrogeli sono comunemente usati come impalcature in ingegneria tissutale a causa loro commonalities biofisica e biochimica con la matrice extracellulare (ECM)9,10. Polimeri naturali sono scelte comuni per ponteggi, in quanto sono biocompatibili e si trovano in molti tessuti del corpo. La limitazione dell’utilizzo di polimeri naturali come substrati è che mancano moiety chimica facilmente manipolabile per bioconjugation. D’altra parte, idrogel sintetico, in quanto tale come PEG, sono eccellenti piattaforme per prodotti chimici mirati per11,12. Inoltre, idrogeli PEG non suscitare una risposta cellulare e pertanto vengono utilizzati come backbone di inerte per la creazione di strutture bioattive.
Per creare idrogeli bioattivi, fotopolimerizzazione sia del tiolo-ene scegliere chimica reazioni sono impiegate. Questi FOTOREAZIONI richiedono un fotoiniziatore e una sorgente di luce UV. Quando fotoiniziatori vengono introdotti ai raggi UV, obbligazioni rompono per formare i radicali. Tesi i radicali sono necessari per avviare la reazione ma possono influire negativamente sulle proteine bioattività12,13. Di conseguenza, è fondamentale ottimizzare fotoiniziatore e tempi di esposizione UV per mantenere la bioattività di proteina.
In questo metodo, idrogeli sono sintetizzati attraverso acrilato-acrilato catena crescita fotopolimerizzazione. PEG-Diacrilato (PEGDA) monomeri reagiscono con a vicenda per formare reti di polimero ramificato responsabile della struttura dell’idrogel. La concentrazione dei monomeri PEGDA all’interno della soluzione di precursore di gel controllerà la rigidità del substrato. Dovuto la piccola dimensione dell’idrogel dei pori, proteine ECM come fibronectina possono essere facilmente incorporate all’interno di idrogel ai fini del collegamento delle cellule. Infine, questi idrogeli possono essere a superficie-fantasia con peptidi bioattivi o proteine via tiolo-ene clicca chimica reazioni. Qui, acrilati non reagiti gratuiti all’interno del sistema di idrogel reagirà con tioli gratuiti situati sulla proteina o peptide quando esposto a luce UV. Dopo le proteine o peptidi sono immobilizzati sulla superficie dell’idrogelo, l’idrogel possono essere memorizzati a 4 ° C per diverse settimane senza perdere la bioattività. Questo offre convenienza, flessibile pianificazione sperimentale e la possibilità di collaborazione tra i laboratori. Nel complesso, questa piattaforma permette di controllo biochimico biomeccanico e spaziale, indipendente uno da altro, per l’opportunità di influenzare il comportamento cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo per la creazione di modelli di proteine bioattive per applicazioni biologiche. Ci sono diverse modifiche che possono essere fatte per adattare questo protocollo per diversi esperimenti. In primo luogo, requisiti di collegamento cella varierà per diversi tipi di cellule. Se inizialmente si osserva un collegamento scadente delle cellule per i gel, aumentando la concentrazione della proteina all’interno della soluzione di precursore ECM è consigliato. Altre proteine ECM possono essere …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto principalmente da sovvenzioni dalla American Heart Association scienziato sviluppo concessione (12SDG12050083 alla GD), il National Institutes of Health (R21HL102773, R01HL118245 alla GD) e della National Science Foundation (CBET-1263455 e CBET-1350240 alla GD).
Materials
| PEG-diacrylate (PEGDA) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-3400 | Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used. |
| Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Synthesized in lab | ||
| Fibronectin | Corning | 356008 | Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | D8537-500ML | |
| Photomask | FineLine Imaging | n/a | Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI. |
| Binder Clips | Various Vendors | ||
| Compact UV Light Source (365nm) | UVP | UVP-21 | Other UV light sources can be used, calibration of power is required. |
| 2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) | Thermo Sci. | 26101 | |
| Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Sci. | 22582 | |
| human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | passage number between 6- 10 | |
| EGM-2 Media | Lonza | CC31-56, CC-3162 | EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance |
| 0.25% Trypsin EDTA | Life Tech | 25200-056 | |
| Trypsin Neutralizer | Life Tech | R-002-100 | |
| Centrifuge | Various Venders | ||
| Hemocytometer | Hausser Sci. Bright-line | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E6758 | |
| 0.22µm filter | Cell Treat | 229743 | |
| 1mL Syringe | |||
| Glass Microscope Slides | Fisher Sci. | 12-550C | |
| Plastic spacers | Various Venders | 0.5mm thickness | |
| 70% Ethanol | BICCA | 2546.70-1 | |
| Bio-shield | Bio-shield | 19-150-0010 | |
| Bradford Reagent | BIO-RAD | ||
| Desalting Resin – Sephadex G-25 | GE Healthcare | 95016-754 | |
| Microspin Columns | Thermo Sci. | PI69725 | |
| AR-G2 rehometer | TA Instruments |
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