Summary
El presente método sirve para identificar inhibidores de la isoforma específica de histona deacetilasas (HDAC) en células HeLa por el análisis UHPLC-MS de múltiples sustratos. Este es un método libre de anticuerpos desarrollado para reflejar actividad HDAC1 y HDAC6 en la vida del ambiente celular, en contraste con solo isoform análisis sin células.
Abstract
La búsqueda de nuevos inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) es de creciente interés en el descubrimiento de medicamentos. Isoforma selectividad ha sido el centro de atención desde la aprobación de la romidepsina, una clase que las HDACS inhibidor para el tratamiento del cáncer y la investigación clínica de los inhibidores de la HDAC6 específico para el mieloma múltiple. El presente método permite determinar la actividad inhibitoria de los compuestos de prueba en HDAC1 y HDAC6 en las células. La actividad de la isoforma se mide utilizando la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-análisis de espectrometría de masas (UHPLC-MS) de sustratos específicos que se incubaron con células HeLa tratadas y no tratadas. El método tiene la ventaja de reflejar la actividad HDAC endógena dentro del entorno de la célula, en contraste con ensayos bioquímicos sin células en isoformas aislado. Por otra parte, porque se basa en la cuantificación de sustratos sintéticos, el método no requiere el reconocimiento de anticuerpos de proteínas endógenas acetilados. Es fácilmente adaptable a varias líneas celulares y un proceso automatizado. El método ya ha demostrado ser útil en la búsqueda de compuestos HDAC6 selectivo en neuroblastos. Aquí se muestran resultados representativos con el estándar HDAC inhibidores tricostatina A (no específica), MS275 (HDAC1-específica), y tubastatin (HDAC6-específico) con células HeLa.
Introduction
Las HDACs pertenecen a una familia de enzimas capaces de deacetylate histonas dentro de la estructura de la cromatina. También tienen otros substratos de la proteína en el citosol y se encuentran en diferentes compartimentos celulares. Un total de 18 HDAC isoformas se han identificado hasta ahora y se han relacionado con varios mecanismos de la célula, incluyendo la regulación de factores de transcripción y expresión génica, así como la señalización celular y transporte1,2,3,4,5,6,7. Inhibidores de la HDAC catalíticos han surgido como potenciales medicamentos para terapia del cáncer. Más inhibidores de las HDACS actualmente aprobados por la FDA para el tratamiento del linfoma del T-cell y el mieloma múltiple y son inhibidores de las HDACS no específicos, tales como vorinostat (SAHA), belinostat y panobinostat8,9. Sin embargo, una serie de efectos secundarios se han asociado con inhibidores de la cacerola, y la búsqueda de moléculas pequeñas de la isoforma específica es un tema candente en descubrimiento de química y drogas medicinal. En consecuencia, la clase me romidepsina inhibidor selectivo (HDAC1-3 y HDAC8) es un medicamento ya aprobado10, mientras que los inhibidores específicos de la HDAC6 son actualmente bajo ensayos clínicos, con mayor potencial terapéutico en el mieloma múltiple11,12,13,14,15.
Selección de ensayos para caracterizar las HDACS inhibidores están basados en la incubación de un sustrato HDAC con una fuente enzimática (isoforma sola, extracto nuclear o lisado de célula). El sustrato es generalmente una secuencia de péptido pequeño que contiene un residuo de lisina de acetilo acoplado a un fluoróforo divisible (por ejemplo, cumarina), como N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. Para distinguir entre las actividades de la isoforma específica, análisis sin células separados que implica cada isoforma son necesarios y podrían no reflejar la actividad de la isoforma real en las células vivas. Específica de isoforma sustratos están comercialmente disponibles, como bencílico (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 sustrato específico) y (éster terc-butílico ácido de S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic (BATCP, sustrato específico HDAC6) (figura 1B). Sin embargo, una mezcla de varios sustrato que contiene MAL, MOCPAC y BATCP a las células vivas no permitirá la detección de los productos desacetilados de medición fluorométrica, dado que llevan el mismo fluoróforo escindibles.
El método aquí descrito permite la detección y cuantificación relativa de cada sustrato y su producto desacetilado en células HeLa, usando un análisis de múltiples sustrato seguido de UHPLC-ESI-MS/MS análisis17. Un análisis de las HDACS se lleva a cabo en las células HeLa que permitan la identificación directa de la actividad inhibitoria de las HDACS y de la especificidad de la prueba de compuestos sobre las HDACs endógenas. Hay un enfoque en HDAC1 y HDAC6, que son evaluados al mismo tiempo. Para lograr estas mediciones enzimáticas en un ensayo de incubación única, una mezcla de sustratos HDAC no específicos y específicos se agrega a las células HeLa tratadas y no tratadas sobre una placa de 96 pocillos. Tras un paso de incubación, las células son sometidas a lisis para liberar a los sustratos y sus productos de la reacción respectiva, que se separan y detectan utilizando un método de UHPLC-MS (figura 1). Los productos desacetilados de los sustratos MAL MOCPAC y BATCP son el MAL desacetilado (dMAL) MOCPAC desacetilado (dMOCPAC) y BATCP desacetilado (dBATCP), respectivamente. Curvas de dosis-respuesta se pueden construir con compuestos activos.
Figura 1: esquema General para el análisis de las HDACS basadas en células identificar inhibidores específicos de HDAC1 y HDAC6 por el análisis UHPLC-MS de múltiples sustratos. (A) esquema de una típica placa de 96 pocillos que contienen tratados (compuestos de prueba) y las células HeLa sin tratamiento (control), así como espacios libres de células. (B) estructura química de sustratos ha añadido como una mezcla (21 μm) a desacetilado de HDACs endógenas. (C) cromatograma típico UHPLC-MS que muestra los picos de los sustratos agregados (MAL MOCPAC y BATCP) y sus productos desacetilados (dMAL, dMOCPAC y dBACTP, respectivamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
1. cultivo celular
Nota: Los siguientes pasos se realizan en una campana de cultivo de tejidos estándar. Se espera que la familiaridad con técnica estéril.
- Cultivo de células HeLa a confluencia del 80% en un matraz de cultivo celular T75 en MEM suplementado con 10% suero fetal bovino, penicilina G (100 U/mL) y estreptomicina (100 mg/mL).
Nota: Cultura, el tratamiento y pasos de lisis celular se llevan a cabo bajo flujo laminar, con pasos de incubación de células a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% CO2 en condiciones estériles. - Lavan las células dos veces con 5 mL de DPBS, aspirar la DPBS y añadir 1 mL de reactivo de disociación celular. Incubar a 37 ° C durante 5 min separar las células.
- Añadir 9 mL de medio de cultivo MEM, bien suspender la suspensión de células y contar las células usando un hemocitómetro.
- Ajustar la densidad de la suspensión celular en 6 x 104 células/mL de MEM.
- Añadir 100 μl de la suspensión celular a control y prueba de los pozos de una placa de 96 pocillos estéril, fondo plano, tratada con cultivo de tejidos (figura 1A).
- Añadir 100 μl de medio de cultivo MEM a pozos en blanco de la placa de 96 pocillos (figura 1A).
- Incubar la placa de 96 pozos a 37 ° C durante 24 h.
Nota: Una incubación de 24 h es un momento adecuado para probar la actividad HDAC endógena en las células HeLa. Diferentes tipos de células con actividad HDAC desconocido pueden necesitar una evaluación timecourse de las células del control.
2. células: tratamiento con compuestos de prueba y sustratos HDAC
- Aspire el medio de los pozos de la placa de 96 pocillos.
- Añada 25 μl de 2 x test compuestos (p. ej., tricostatina A, MS275 y tubastatin A) en el MEM para prueba de pozos. Añada 25 μl de MEM a control y pozos en blanco.
Nota: La concentración de compuestos de la prueba debe ajustarse para proporcionar una gama de concentraciones de ensayo final por lo menos 5 (a una concentración por pozo). La concentración final de DMSO en la sustancia de ensayo no debe exceder 0.5% y debe ser el mismo en cada pocillo, incluyendo espacios en blanco y los controles. El volumen final de la incubación es de 50 μL por pocillo. A Trichostatin es probado en 5 concentraciones que van desde 500 hasta 1,95 nM (dilución 1:4). MS275 y tubastatin A son probados a 5 concentraciones que van desde 8.000 hasta 6.17 nM (dilución 1:6). La concentración de la prueba final deseado para cada sustancia de ensayo debe determinarse por cada usuario individual mediante la creación de una curva dosis-respuesta. - Añadir 25 μl de la mezcla de sustrato (42 μm de MAL, 42 μm de MOCPAC y 42 de la BATCP en MEM) a pozos de control y de prueba. Añadir 25 μl de MEM a pozos en blanco.
Nota: La concentración final de cada sustrato es 21 μm. MOCPAC y BATCP distinguir entre actividad de HDAC1 y HDAC6, respectivamente (figura 1B). Cuando no hay actividad se observa con los sustratos, el uso de MAL podría llevar potencialmente a la identificación de la actividad contra otra isoforma HDAC. - Incubar la placa de 96 pozos a 37 ° C durante 8 h en un 5% humidificado incubadora de CO2 .
Nota: Este tiempo de incubación es conveniente para las células HeLa y permite la HDAC endógeno interactuar con los sustratos sintéticos. Diferentes líneas celulares pueden requerir ajustes en la concentración de tiempo o sustrato de incubación.
3. la célula Lysis y preparación de muestras para UHPLC-ESI-MS/MS
PRECAUCIÓN: Los pasos de preparación de muestra usan productos químicos orgánicos, que son altamente inflamables y tóxicos por ingestión o inhalación. Utilice protección personal adecuada, como guantes y gafas de seguridad.
- Añadir 10 μl de tampón de x RIPA 6 (diluido de 10 x RIPA buffer) con inhibidor de la proteasa en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
- Detener la reacción añadiendo 160 μl de acetonitrilo frío a cada pozo y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.
Nota: Mantenga el acetonitrilo a-20 ° C antes de este paso. - Colocar la placa en un congelador de-80 ° C durante 10 minutos.
- Retire la placa del congelador y transferencia 220 μl del contenido de cada pocillo de una placa de 96 pocillos estériles, cónico-parte inferior (V abajo). Centrifugar la placa a 5.000 x g y 4 ° C durante 10 minutos.
Nota: Este paso tiene como objetivo eliminar las proteínas y sales. Si es necesario, las soluciones pueden ser transferidas a tubos de centrífuga cónicos individuales antes de centrifugar o filtradas a través de un conjunto de 96 pocillos, placas de filtro PVDF de 0,65 μm. El retiro acertado del precipitado es necesario antes del análisis UHPLC. - Transfiera 200 μL de sobrenadante (o filtrado) en una placa de 96 pocillos compatible con el sistema UHPLC y séllelo con papel pelable, soldadura usando un sellador de placas.
Nota: Evitar pipetear las pelotillas al retirar el sobrenadante. Si no puede realizarse inmediatamente el análisis UHPLC, la placa puede guardarse a 4 ° C por un máximo de 24 h hasta su análisis.
4. UHPLC/MS-MS. Análisis
- Preparar el sistema UHPLC rellenando con el sistema de fase móvil (95% A:5% B):
R: H2O, grado HPLC, que contiene 0.1% de ácido fórmico (preparar 1 L)
B: acetonitrilo, grado HPLC, que contiene 0.1% de ácido fórmico (preparar 1 L).
PRECAUCIÓN: La fase móvil contiene productos químicos orgánicos, que son altamente inflamables y tóxicos por ingestión o inhalación. Utilice protección personal adecuada, como guantes y gafas de seguridad. - Coloque la placa de 96 pocillos en el administrador muestra que contiene un sostenedor de la placa. Ejecutar las muestras según las condiciones UHPLC-ESI-MS/MS proporcionadas en la tabla 1.
Nota: Cada columna de la placa de 96 pocillos analítica debe tener así un control y un pozo en blanco (como se muestra en el esquema de la placa de la figura 1A). Los controles son representativos de 100% de actividad enzimática en la línea celular probado, durante los espacios en blanco comprobar si la fuente MS proporciona antecedentes consistentes. Picos de MS inusuales detectadas en un determinado espacio en blanco deben ser investigados para prevenir MS cambios de sensibilidad.
5. Análisis de datos
- Integrar el área de pico de cada sustrato y su producto desacetilado con un software de integración apropiado de UHPLC.
Nota: Utilizar parámetros de integración automática con un método de suavizado (media, tamaño de la ventana 3 y número de Lisa 2, por ejemplo). Usando las condiciones cromatográficas proporcionadas en la tabla 1, el orden de elución es dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (mínima 6,2), MAL (min 7,6), MOCPAC (8,9 min) y BATCP (9,8 min), como se muestra en la figura 1. - Para cada sustrato, calcular la proporción del área pico (desacetilado/acetilado) en cada cromatograma (muestras de control y de test).
- Calcular el porcentaje inhibición de la HDAC de cada muestra:
Nota: Inhibición de HDAC1 se calcula utilizando la proporción del área pico de dMOCPAC/MOCPAC; HDAC6 inhibición se calcula con dBATCP/BATCP. La relación dMAL/MAL puede utilizarse para expresar general inhibición de la HDAC.
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Representative Results
Para demostrar la aplicación del método para identificar inhibidores selectivos y no selectivos para HDAC1 (clase I) y HDAC6 (clase IIb), las células HeLa fueron tratadas con compuestos estándar conocidos: tricostatina A (no selectivo entre HDAC1 y HDAC6)18y MS275 (inhibidor selectivo de HDAC1)19tubastatin (inhibidor selectivo de HDAC6)20. Mediante el método actual (figura 1), valores de IC50 podrían directamente determinar en las células vivas para HDAC1 (analizando desacetilación MOCPAC) y HDAC6 (por mirar desacetilación BATCP) (figura 2). Trichostatin A es un inhibidor potente pero no selectivo a HDAC1 y HDAC6. Por otra parte, MS275 era selectivo para HDAC1, mientras que tubastatin A era claramente selectivo para HDAC6.
Figura 2: Curvas de IC50 dosis-respuesta se obtuvieron simultáneamente para HDAC1 y HDAC6 de tres inhibidores de las HDACS estándar: la tricostatina no selectivo A, el MS275 selectivo de HDAC1 y la HDAC6 selectivo tubastatin A. Valores de IC50 presentados en la tabla adyacente son la media ± SD de tres mediciones independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Volumen de inyección | 5 ΜL |
| Columna | C18 (2,6 μm, 100 mm x 3 mm i.d.) |
| Temperatura de columna | 40 ° C |
| Tasa de flujo de elución | 0,8 mL/min (rango de presión típico: 400-600 bares) |
| Gradiente de elución | B 5-45% en 10 minutos |
| B 45-98% en 2 minutos | |
| Paso de lavado | 98% B durante 2 min. |
| Equilibra el paso | 5% B durante 4 min. |
| ESI-MS/MS | voltaje de cono, 30 V; voltaje de la fuente capilar, 3.0 kV; temperatura del capilar, 350 ° C; temperatura de la fuente, 120 ° C; funda gas - nitrógeno (600 L/h); presión de gas de colisión, argón a 3 x 10-3 mbar |
| Parámetros de colisión y los canales de reacción optimizados con un tiempo de 0.1 s, 0,01 s de interscan retrasa y energía de la colisión situado a 20 eV. | |
| Detección de MAL con masa de transiciones → → 346 (MAL) y 404 446 304 (dMAL). | |
| Detección de MOCPAC con masa de transiciones → → 449 (MOCPAC) y 439 494 394 (dMOCPAC). | |
| Detección de BATCP con masa transiciones 500 → → 400 (BATCP) y 476 376 (dBATCP). |
Tabla 1: Condiciones de UHPLC-ESI-MS/MS.
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Discussion
Inhibición de la HDAC es un tema candente en el descubrimiento de medicamentos, con un enfoque actual en HDAC6 selectivo inhibidores de cáncer terapia21. Selectividad HDAC es evaluado generalmente por una serie de ensayos de alto rendimiento, libres de células, que pretenden determinar la potencia inhibitoria hacia individuales HDAC isoformas21. Sin embargo, la selectividad de un inhibidor debe ser además confirmada en las células vivas por evaluar el estado de acetilación de sustratos de la proteína endógena, como las histonas (para clase I las HDACs) y tubulina (para HDAC6). Por lo tanto, la célula de ensayos que implican reconocimiento de anticuerpos (p. ej., immunostaining, western blot, citometría de flujo y ELISA) son generalmente necesarios para lograr una evaluación cuantitativa o semi-cuantitativa de las isoformas de potencia de un compuesto dado en la vida de las células21. No es raro que un compuesto que fue selectivo en un ensayo enzimático sin células resulta para ser no selectiva en células o tejidos17,22y vice versa19. Esto puede explicarse por diferencias en fuentes enzimáticas no normalizadas y la ausencia de factores o proteínas parejas en ensayos bioquímicos21.
El método descrito aquí es una alternativa rápida, libre de anticuerpos, lo que permite la medida directa de la clase I (HDAC1) y clase IIb (HDAC6) potencia inhibitoria en la vida de la célula ambiente17. Otra ventaja del método es que puede ser fácilmente adaptado a diferentes líneas celulares, tales como neuroblastos23, con la posibilidad de miniaturización y automatización, según se describió anteriormente para otros ensayos celulares24. La detección de sustratos específicos por espectrometría de masas contribuye a la medida exacta de los productos desacetilados, proporcionar resultados cuantitativos comparables. Este es el primer método disponible para determinar valores de IC50 hacia específicas HDAC isoformas en células vivas. A manera de comparación, el perfil selectivo no cuantitativa de inhibidores de las HDACS observado por western blot se han demostrado estar en consonancia con el perfil de selectividad obtenido con el método descrito aquí17. Aunque este método ha sido desarrollado para el descubrimiento de nuevos inhibidores HDAC clase selectiva, también se podría aplicar para medir la actividad HDAC en modelos celulares en el curso de una enfermedad. Esto podría contribuir a la elucidación de mecanismos epigenéticos y moleculares en enfermedades relevantes y potencialmente podría identificar a fármacos candidatos. En vista de la extrapolación de este método hacia HDAC isoformas distintas HDAC1 y HDAC6, se recomienda el desarrollo de nuevos sustratos HDAC selectivos. Por otra parte, la especificidad de sustrato de MOCPAC y BATCP debe caracterizarse completamente en términos de focalización isoformas individuales. De hecho, mientras que MOCPAC está clasificado como un sustrato de HDAC1 específicos (clase I clase II), es más probable que sea un genérico clase I sustrato (incluyendo HDAC3 isoforma), como previamente demostrada25. Por consiguiente, BATCP es un conocido sustrato HDAC6 selectivo (clase II clase sobre las HDACs), pero su especificidad hacia otra clase II HDACs, como HDAC4, merece mayor caracterización25.
Actividad enzimática puede variar dependiendo de la línea celular, tiempo de incubación, número y confluencia de la célula. Cuando una línea celular se utiliza por primera vez en el ensayo, es importante probar una gama de concentraciones de sustrato en las células de control, en diferentes momentos, para analizar la cinética de la enzima por UHPLC-MS (por ejemplo, a través de una trama de Michaelis-Menten). Esto permitirá que los investigadores al elegir la concentración más adecuada de tiempo y sustrato de incubación. Esta elección se basa en dos parámetros principales: 1) la cinética de la enzima y 2) la detección de los sustratos y sus productos desacetilados. Al analizar la cinética de la enzima, es esencial para evaluar los valores de velocidad inicial (es decir, cuando la formación de producto está dentro del rango lineal) para establecer la cinética de la enzima. Según la cinética, las concentraciones de sustrato en la Km deben ser elegidas para proporcionar un exacto porcentaje de inhibición, especialmente en el caso de los inhibidores competitivos y no competitivos26. Por otro lado, la concentración del substrato elegido debe proporcionar señales MS detectables y cuantificables para el sustrato y el producto desacetilado (relación señal a ruido ≥ 20)17. Cuando se utilizan varios substratos, el método cromatográfico debe garantizar la separación de los picos que se analizará. Sistemas alternativos de cromatografía pueden requerir cambios en el tipo de degradado y la columna de separación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen costo acción CM1406 (epigenéticos Biología química). Investigación en esta publicación fue apoyada por la Fundación Pierre Mercier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
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