Summary
本手法は複数基板の UHPLC MS 解析によるヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) HeLa 細胞でのアイソ フォーム特異阻害剤を識別するために提供しています。これは生活 HDAC1 と HDAC6 の活動を反映するように開発された抗体無料メソッド セル環境、単一アイソ フォーム細胞アッセイとは対照的。
Abstract
創薬における関心は高くなり新しいヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤の検索では。アイソ フォーム選択性ロミデプシン、クラス成立以来脚光を浴びている私は HDAC 阻害剤癌治療の多発性骨髄腫の特定の HDAC6 阻害剤の臨床的検討。現在のメソッドを使用して、HDAC1 とセルに HDAC6 試験化合物の阻害活性を決定します。アイソ フォームの活動は、超高速液体クロマトグラフィー-質量分析法 (クロマト ・ MS) 解析処理と未処理の HeLa 細胞と培養の特定の基板を使用して測定されます。メソッドには、分離のアイソ フォームで実施無料の細胞生化学的アッセイとは対照的、細胞環境で内因性 HDAC 活動を反映しての利点があります。さらに、それは合成基板の定量化に基づくが、ためメソッドは内生アセチル化タンパク質の抗体認識を必要ありません。それはいくつかの細胞株および自動化されたプロセスに容易に適応です。メソッドはすでに神経 HDAC6 選択的化合物を見つけることに有用な証明されています。典型的な結果をここに示します標準 HDAC 阻害剤トリコスタチン、(非特定の)、MS275 (HDAC1 固有の)、tubastatin (HDAC6 固有) を用いた HeLa 細胞と。
Introduction
Hdacs をしたはクロマチン構造中のヒストンを deacetylate することができる酵素の家族に属しています。また、細胞質で他の蛋白質の基質がある、細胞の様々 な区分であります。18 HDAC アイソ フォームの合計これまで同定されている細胞シグナル伝達し同様に、転写因子や遺伝子発現の調節など、いくつかの細胞メカニズムに関連しているし、1,2,3,4,5,6,7を輸送します。触媒の HDAC 阻害剤はがん治療のための潜在的な治療薬として浮上しています。ほとんど HDAC の抑制剤は、現在 FDA によって承認されて T 細胞リンパ腫、多発性骨髄腫の治療のため、ボリノスタット (サハ)、belinostat、パノビノスタット8,9などの非特異的 HDAC 阻害剤です。しかし、副作用のシリーズはパン阻害薬に関連付けられている、アイソ フォーム特異的小さな分子の検索は、薬効がある化学および薬剤の発見のホットな話題。したがって、クラス私 (HDAC1 3 と見られる HDAC8) の選択的阻害剤ロミデプシンは既に承認された薬10特定の HDAC6 阻害剤は、現在多発性骨髄腫11,12,13,14,15に高められた治療の可能性と、臨床試験中。
スクリーニング アッセイ HDAC を特徴づける阻害剤は酵素ソース (1 つのアイソ フォーム、核エキスまたは細胞ライセート) と HDAC 基板のインキュベーションに基づいています。基材は通常 N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (マル)16など分解蛍光体 (例えばクマリン) と結合したアセチル リジン残基を含む小さいペプチッド シーケンスです。アイソ フォーム固有のアクティビティを区別するために各アイソ フォームを含む別の無料のセル アッセイが必要と細胞内本物のアイソ フォームの活動を反映していないこと。アイソ フォーム固有の基板ベンジルなど、市販されている (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC、HDAC1 特異的基質) と (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic 酸 tert-ブチル エステル (BATCP、HDAC6 特異的基質) (図 1 b)。ただし、マルを含む複数基質混合物、MOCPAC、および BATCP 細胞に与えられるを許可しません個々 されたきちん製品の検出蛍光測定による同じ分解蛍光体を抱くことを考える。
ここで説明する方法は、検出と各基板とそのされたきちん製品 UHPLC-ESI ・ MS/MS 分析17続いてマルチ基板アッセイを用いた HeLa 細胞での相対的な定量化のためことができます。HDAC 阻害活性と内因性 hdacs をした試験化合物の特異性の直接同定法を有効に HeLa 細胞に HDAC アッセイを行ったHDAC1 と HDAC6 が同時に評価の焦点があります。単一培養の試金でこれらの酵素の測定を達成するため、96 ウェル プレートにメッキ処理と未処理の HeLa 細胞を非特異的, 特異 HDAC の基板上の混合物を追加します。インキュベーションのステップでは、次のセルは基板と区切られ、UHPLC-質量分析法 (図 1) を使用して検出された彼らのそれぞれの反応製品を解放する服従に分離します。マル、MOCPAC、および BATCP の基板のされたきちんの製品は、それぞれされたきちん MAL (dMAL)、されたきちん MOCPAC (dMOCPAC) とされたきちん BATCP (dBATCP) です。用量反応曲線は、活性化合物を構築できます。
図 1: 複数基板の UHPLC MS 解析による HDAC1 固有、HDAC6 阻害剤を識別するために細胞を用いた HDAC 試金のための一般的な方式です。(A) 方式、標準の 96 ウェル プレート治療 (試験化合物を含む) の (無処理) HeLa 細胞と無細胞ブランク。(B) 混合物 (各 21 μ M) として内因性 hdacs をした、されたきちんするのに追加基板の化学構造。(C) (マル、MOCPAC、および BATCP) の追加基板とされたきちん製品のピークを示す典型的なクロマト ・ MS クロマト グラム (dMAL、dMOCPAC と dBACTP、それぞれ)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Protocol
1. 細胞培養
注: 次の手順は、標準のティッシュ文化フードで実行されます。生殖不能の技術に精通するいるとされます。
- 10% 牛胎児血清ペニシリン G を添加した MEM でコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコの 80% の confluency に HeLa 細胞の培養 (100 U/mL) とストレプトマイシン (100 mg/mL)。
注: セル文化、治療、および換散の手順は 5% CO2無菌条件下での加湿雰囲気で 37 ° C で細胞培養手順を伴う層流の下で行われます。 - DPBS 5 mL で 2 回洗浄、吸引、DPBS 細胞解離試薬 1 mL を加えます。セルをデタッチする 5 分の 37 ° C で孵化させなさい。
- MEM 培地の 9 mL を追加し、徹底的に細胞懸濁液を再懸濁します、診断を使用してセルをカウントします。
- 6 × 104セル/ml MEM に細胞懸濁液の密度を調整します。
- コントロールに細胞懸濁液 100 μ L を追加し、(図 1 a)、滅菌、平底、組織培養治療 96 ウェル プレートの井戸をテストします。
- 96 ウェル プレート (図 1 a) の空井戸に MEM 培地の 100 μ L を追加します。
- 24 h の 37 ° C で 96 ウェル プレートを孵化させなさい。
注: 24 時間培養は、HeLa 細胞の内因性 HDAC アクティビティをテストする適切な時間です。不明な HDAC 活動と異なるセル型は、制御の細胞の経時的評価を必要があります。
2 テスト混合物と HDAC 基板細胞治療
- 96 ウェル プレートの井戸から培地を吸引します。
- テスト混合物 x 2 を 25 μ l 添加(例えば、トリコスタチン A、MS275、tubastatin、) 井戸をテストする MEM で。コントロールと空白の井戸に MEM の 25 μ L を追加します。
注: テスト混合物の濃度は、少なくとも 5 の最終的な試験濃度 (ウェルあたり 1 つ濃度) の範囲を提供するために調整することです。化合物のテストで DMSO 最終濃度 0.5% を超えないようにする必要があります、空白やコントロールを含む、各ウェルで同じである必要があります。最終的なインキュベーション ボリュームは、ウェルあたり 50 μ L です。トリコスタチン A は 500 から 1.95 に至るまで 5 の濃度テスト nM (1:4 希釈)。6.17 8,000 に至る 5 濃度テストする MS275 と tubastatin A nM (希釈 1:6)。各々 のユーザーが目的の最終的なテスト各試験化合物濃度を決定して用量反応曲線を作成してください。 - コントロールとテスト井戸に基板の混合物 (マル、MOCPAC の 42 μ M と MEM で BATCP の 42 μ M 42 μ M) の 25 μ L を追加します。空井戸に MEM の 25 μ L を追加します。
注: 各基板の最終濃度は 21 μ M. MOCPAC と BATCP がそれぞれ HDAC1 と HDAC6 の活動の区別 (図 1 b)。エピウエハーと活動は認められなかったと、マルの使用可能性別 HDAC アイソ フォームに対する活動の id。 - 加湿 5% で 8 h の 37 ° C で 96 ウェル プレートを孵化させなさい CO2インキュベーター。
注: このインキュベーション時間は HeLa 細胞に適しており、合成の基質と対話する内因性 HDAC をことができます。細胞は培養時間および/または基板濃度の調整を必要があります。
3. 細胞換散およびクロマト ・ MS/MS のサンプル準備
注意: サンプルの準備の手順は非常に可燃性、摂取または吸入によって有害有機化学物質を使用します。呼吸用保護具、手袋、保護メガネなどを着用してください。
- X RIPA バッファーを 6 (10 x RIPA バッファーから希釈) 96 ウェル プレートの各ウェルにプロテアーゼ阻害剤を添加したの 10 μ L を追加します。
- 冷たいアセトニ トリルの 160 μ L を各ウェルに追加によって反作用を停止し、上下にピペッティングで混ぜます。
注: この手順の前に-20 ° C で、アセトニ トリルを続けます。 - 10 分間-80 ° C のフリーザーにプレートを配置します。
- 冷凍庫からプレートを削除し、各ウェルの内容の 220 μ L を生殖不能、円錐底 (V 下) 96 ウェル プレートに転送します。5,000 × g と 10 分のための 4 ° C でプレートを遠心します。
注: この手順は、蛋白質および塩の取り外しを目指しています。必要に応じて、ソリューションを遠心分離前に個々 の円錐形遠心チューブに転送または 0.65 μ m PVDF フィルター プレート 96 ウェルのセットをフィルター処理できます。沈殿物の成功の除去は、クロマト分析の前に必要です。 - UHPLC システムと互換性のある 96 ウェル プレートに上清 (または濾液) の 200 μ L を転送し、プレートのシーラーを使用して剥離、ヒートシールの箔シールします。
メモ: は、培養上清を削除する場合は、ペレットをピペッティングしないでください。クロマト分析を即座に実行できない場合は、分析まで 24 h 最大 4 ° C でプレートに格納できます。
4. UHPLC/MS-質量分析
- 移動相システム (95% A:5 %b) で塗りつぶすことにより UHPLC システムを準備します。
A: H2O、HPLC グレード 0.1% ギ酸を含む (1 L を準備)
B: アセトニ トリル、HPLC グレード, 0.1% ギ酸を含む (1 L の準備)。
注意: 移動相には、非常に可燃性、摂取または吸入によって有毒な有機化学物質が含まれています。呼吸用保護具、手袋、保護メガネなどを着用してください。 - 96 ウェル プレートは、プレート ホルダーを含むサンプル マネージャーに。表 1にクロマト ・ MS/MS 条件に従ってサンプルを実行します。
注: 分析の 96 ウェル プレートのすべての列も、よく 1 つのコントロールと 1 つの空白も (図 1 aのプレート方式で描かれている) です。コントロールが、ブランクがある MS ソースは一貫性のある背景を提供するかどうかを確認するテスト細胞の酵素活性を 100% の代表。指定された空白で検出された異常な MS ピークスは、MS 感度変更を防ぐために調べる必要があります。
5. データの解析
- 各基板とそのされたきちん製品のピーク面積を適切なの UHPLC 統合ソフトウェアに統合します。
注: は、平滑化手法 (平均、ウィンドウ サイズ 3 と 2 を例えば滑らかの数) と自動統合パラメーターを使用します。表1 クロマトグラフィー条件を使用して、溶出順序は、dMAL (5.8 分)、dBATCP (6.0 分)、dMOCPAC (6.2 分)、マル (7.6 分)、MOCPAC (8.9 分)、BATCP (9.8 分)、図 1に示されています。 - 各基板 (されたきちん/アセチル化) (テストおよび制御サンプル) 各クロマト グラムのピーク面積比を計算します。
- 各テスト サンプルのパーセント HDAC 阻害を計算します。
注: HDAC1 阻害は、dMOCPAC/MOCPAC; のピーク面積比を使用して、計算します。HDAC6 阻害は、dBATCP/BATCP と計算されます。比 dMAL/マルは、一般的な HDAC 阻害を表現する使用できます。
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Representative Results
メソッドの HDAC1 の非選択性選択的阻害物質の識別への応用を実証する (クラス I)、HDAC6 (IIb クラス)、HeLa 細胞は知られている標準的な化合物と扱われた: トリコスタチン A (非選択的 HDAC1 と HDAC6)18MS275 (HDAC1 選択的阻害剤)19、および tubastatin (HDAC6 選択的阻害剤)20。本法 (図 1) を使用して、IC50値直接ごとに決定される細胞内 (MOCPAC 脱アセチル化を見て)、HDAC1、HDAC6 (BATCP 脱アセチル化を見ている) (図 2)。トリコスタチン A は、HDAC1 と HDAC6 に向かって強力な非選択的阻害剤だった。その一方で、MS275 だった、HDAC1 の選択的 tubastatin A は明らかに HDAC6 の選択。
図 2: IC50用量反応曲線を同時に HDAC1 と 3 つの標準的な HDAC 阻害剤の HDAC6 の取得: 非選択的トリコスタチン A、HDAC1 選択的 MS275、HDAC6 選択 tubastatin a.隣接するテーブルに表示される IC50値は、3 つの独立した測定の平均 ± SD です。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 注入量 | 5 Μ L |
| 列 | C18 (2.6 μ m、内径 100 mm × 3 mm) |
| カラム温度 | 40 ° C |
| 溶出量 | 0.8 mL/分 (典型的な圧力範囲: 400-600 バー) |
| 溶出グラデーション | 10 分で 5-45% B |
| 2 分で 45 98% B | |
| 洗浄ステップ | 2 分間 98% B |
| 均衡化のステップ | 4 分の 5% B |
| ESI MS/MS | コーン電圧 30 V;キャピラリー電圧、3.0 kV;キャピラリー温度、350 ° C;ソースの温度、120 ° C;シース ガス - 窒素 (600 L/h);衝突ガス圧、アルゴン 3 x 10-3 mbar に設定 |
| 衝突パラメーターと 0.1 の滞留時間で最適化された反応チャンネル s、0.01 20 eV で interscan 遅延と衝突エネルギーの s を設定。 | |
| マル検出質量遷移 446 → 346 (MAL) と 404 → 304 (dMAL)。 | |
| 質量転移 494 → 449 (MOCPAC)、439 → 394 (dMOCPAC) MOCPAC 検出。 | |
| 質量転移 500 → 400 (BATCP)、476 → 376 (dBATCP) BATCP 検出。 |
表 1: クロマト ・ MS/MS の条件。
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Discussion
HDAC 阻害は、がん療法21HDAC6 阻害の現在のフォーカスの創薬におけるホットな話題です。HDAC の選択性は通常個々 HDAC アイソ フォーム21に向けて抑制効力を判断する高スループット、携帯無料の試金のシリーズによって評価されます。しかし、阻害の選択性またによって確認されなければならない細胞のヒストンなどの内因性のタンパク質の基質のアセチル化状態を評価する (のクラス I hdacs をした) とチューブリン (HDAC6) のため。したがって、細胞試金の抗体認識 (例えば、免疫染色、西部のしみ、フローサイトメトリー、ELISA) を含む、通常必要なアイソ フォームの定量的または半定量的評価を達成するために生活の特定の化合物の効能細胞21。それは珍しい無細胞酵素アッセイで選択された化合物は細胞や組織の17,22、及び逆19副、非選択的になりますではないです。これは、非標準の酵素源と共同の要因の有無の違いまたは生化学的アッセイ21蛋白質パートナーによって説明できます。
ここで説明した方法は、私 (HDAC1) とクラス IIb (HDAC6) 抑制効力生活クラスの直接測定を可能にする急速な抗体無料代替細胞環境17です。メソッドのもう一つの利点はそれ容易に神経芽細胞23、小型化と自動化、他の細胞に基づく試金24上記のようの可能性などの異なる細胞株に適応することができます。質量分析法による特定の基板の検出は、同等の定量結果が提供されたきちんの製品の正確な測定に貢献します。これは、細胞内の特定の HDAC アイソ フォームに向かって IC50値を決定する最初の方法です。比較の問題としては、ここで17で説明されている方法で得られた選択性プロファイルと一直線にある西部のしみで観測された HDAC 阻害剤の非定量的選択的プロファイルを実証されています。このメソッドは、新しいクラス選択的 HDAC 阻害剤の発見のために開発されている場合でも、病気の経過で細胞モデル内の HDAC のアクティビティの測定にも適用でした。これは関連疾患のエピジェネティクスと分子メカニズムの解明に貢献できるし、薬剤の候補者を識別できる可能性があります。このメソッド以外の HDAC1 と HDAC6 HDAC アイソ フォームの方を外挿するの観点から新しい選択的 HDAC 基板の開発が強く推奨されます。さらに、MOCPAC と BATCP の基質特異性べきである 1 つのアイソ フォームのターゲットの面で完全に特徴付けられます。一方、確かに、HDAC1 固有の基質として MOCPAC を分類 (クラス II の種)、ジェネリック クラス I 以前に実証25(HDAC3 アイソ フォームを含む)、基板である可能性が高いです。したがって、BATCP は、よく知られている HDAC6 選択的基質 (クラス II クラス以上の hdacs をした) が他のクラス II あり, HDAC4 などに向けてその特異性に値するさらに特性25。
酵素活性は細胞株によって異なり、細胞数、密度、およびインキュベーション時間。アッセイで初めて細胞ラインを使用すると、UHPLC MS (例えばミカエリス-メンテン型プロットを通して) による酵素反応速度論を分析する、異なる時点での制御細胞基質濃度の範囲をテストすることが重要です。研究者に最も適したインキュベーション時間と基質濃度を選択できるようになります。この選択は、2 つの主要なパラメーターに依存しています: 1)、酵素反応速度論、2) 基板とそのされたきちん製品の検出。酵素反応速度論を分析する際それが初速値 (すなわち、製品形成が線形の範囲内の場合) を評価する重要な酵素反応速度論を確立します。速度論によると競争し、競争力の阻害剤26の場合は特に、抑制の正確な割合を提供する Km下で基質濃度を選択必要があります。一方、選択した基質濃度は、基板とされたきちん製品 (信号対雑音比 ≥20)17検出および定量化の MS 信号を提供する必要があります。複数の基板を使用している場合、ガスクロマト グラフ法は、分析されるすべてのピークの分離を確認してください。代替のクロマトグラフィー システムは、分離のグラデーションと列の種類に変更を必要があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者認めるコスト アクション CM1406 (エピジェネティックな化学生物学)。この出版物で報告された研究は、ピエール ・ メルシエ財団によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
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