Il presente metodo serve a identificare isoforma-specifici inibitori dell'istone deacetilasi (HDAC) in cellule HeLa dall'analisi UHPLC-MS di substrati multipli. Questo è un metodo privo di anticorpi sviluppato per riflettere l'attività HDAC1 e HDAC6 del vita ambiente cellulare, in contrasto con le analisi senza cellula singola isoforma.
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Articolo metodologico
Misura simultanea di HDAC1 e HDAC6 attività in HeLa Cells utilizzando UHPLC-MS
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricerca di nuovi inibitori delle istone deacetilasi (HDAC) è di crescente interesse nella scoperta della droga. Isoforma selettività è stato sotto i riflettori dopo l'approvazione del romidepsina, una classe ho HDAC inibitore per la terapia del cancro e l'indagine clinica degli inibitori HDAC6-specifico per il mieloma multiplo. Il presente metodo è utilizzato per determinare l'attività inibitoria di sostanze da testare su HDAC1 e HDAC6 nelle cellule. L'attività dell'isoforma è misurata usando la cromatografia liquida ultra-high-performance – analisi di spettrometria di massa (UHPLC-MS) di specifici substrati incubati con cellule HeLa trattate e non trattate. Il metodo ha il vantaggio di riflettere l'attività HDAC endogena all'interno dell'ambiente di cella, in contrasto con analisi senza cellula biochimiche condotte su isoforme isolato. Inoltre, perché si basa sulla quantificazione dei substrati sintetici, il metodo non richiede il riconoscimento anticorpale di proteine endogene acetilati. È facilmente adattabile a diverse linee cellulari e un processo automatizzato. Il metodo ha già dimostrato utile nella ricerca di composti HDAC6-selettiva in neuroblasti. Risultati rappresentativi sono indicati qui con standard HDAC inibitori tricostatina A (non-specifico), MS275 (HDAC1-specifica), e tubastatin un (HDAC6-specifico) utilizzando cellule HeLa.
Introduzione
HDAC appartengono ad una famiglia di enzimi in grado di deacetilano gli istoni all'interno della struttura della cromatina. Hanno anche altri substrati della proteina nel citosol e si trovano in vari compartimenti cellulari. Un totale di 18 HDAC isoforme sono state identificate finora e sono stati collegati con parecchi meccanismi delle cellule, compreso la regolazione di fattori di trascrizione e l'espressione genica, come pure la segnalazione delle cellule e trasporto1,2,3,4,5,
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Protocollo
1. coltura cellulare
Nota: I seguenti passaggi vengono eseguiti in una cappa di coltura di tessuti standard. Familiarità con tecnica sterile è previsto.
- Coltura di cellule HeLa al confluency di 80% in un matraccio di cultura cellulare T75 in MEM completati con 10% siero bovino fetale, penicillina G (100 U/mL) e la streptomicina (100 mg/mL).
Nota: Cultura, il trattamento e passaggi di lisi delle cellule sono condotti sotto flusso laminare, con fasi di incubazione delle cellule a 37 ° C, eseguite in atmosfera umidificata di 5% CO2 in condizioni sterili. - Lavare le cellule due volte con 5 mL di DPBS, aspirare....
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Risultati
Per illustrare l'applicazione del metodo all'identificazione di inibitori selettivi e non selettivi per HDAC1 (classe I) e HDAC6 (classe IIb), le cellule HeLa sono state trattate con composti standard conosciuti: tricostatina A (non-selettivi tra HDAC1 e HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selettivo inibitore)19e tubastatin (HDAC6-selettivo inibitore)20. Utilizzando il presente metodo (Figura 1), valo.......
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Discussione
Inibizione di HDAC è un tema caldo nella scoperta della droga, con un focus corrente su HDAC6-selettivi per cancro terapia21. Selettività HDAC solitamente è valutata da una serie di saggi di alto-rendimento, senza cellula, che intende determinare la potenza inibitoria verso singoli HDAC isoforme21. Tuttavia, la selettività di un inibitore deve essere ulteriormente confermata in cellule viventi valutando lo stato di acetilazione di substrati di proteine endogene, quali gli i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono COST Action CM1406 (epigenetici Chemical Biology). Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dalla Fondazione Pierre Mercier.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Sinonimo: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, grado HPLC | Fisher Scientific 10660131 | ||
| acido formico, grado LC/MS | Fisher | Scientific 10596814 | |
| H2O, | H2O distillato di grado | ||
| Celle HeLa | ATCC, ATCC | , CRM-CCL-2 | |
| Dissociazione cellulare reagente TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, grado per colture cellulari | Applichem | 146463 | |
| DPBS ThermoFisher | Scientific | 14190144 | |
| Siero fetale bovino | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillina-Streptomicina | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x tampone RIPA | Abcam | ab156034 | |
| Compresse di inibitori della proteasi | SigmaFast Piastre Sigma-Aldrich | S8820 | |
| a 96 pozzetti, sterili, a fondo piatto, trattate con coltura tissutale Corning | VWR | 29442-058 | |
| Piastre a 96 pozzetti, non sterili, fondo a V Corning | VWR | 29442-404 | utilizzate nella fase di centrifugazione |
| Piastra a 96 pozzetti, fondo conico, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatibile con il sistema Acquity UHPLC |
| Palloni per colture cellulari T75 Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Lamina termosaldante pelabile | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Software di integrazione: MassLynx V4.1 | Waters | Numero di catalogo non disponibile | |
| Termosigillatrice combinata SP-0669/240 | Waters | Numero di catalogo non disponibile | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Numero di catalogo non disponibile |
Riferimenti
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 ....
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Ristampe e permessi
