Summary
Den nuværende metode tjener til at identificere isoform-specifikke hæmmere af Histon deacetyltransferase (HDAC) i HeLa celler af UHPLC-MS analysen af flere substrater. Dette er et antistof-fri metode udviklet for at afspejle HDAC1 og HDAC6 aktivitet i levende celle miljø, i modsætning til single-isoform celle-fri assays.
Abstract
Søgning efter nye Histon deacetylase (HDAC) hæmmere er af stigende interesse for drug discovery. Isoform selektivitet har været i søgelyset siden vedtagelsen af romidepsin, en klasse jeg HDAC inhibitor for kræftbehandling, og den kliniske undersøgelse af HDAC6-specifikke hæmmere for myelomatose. Den nuværende metode bruges til at bestemme den hæmmende aktivitet test tinforbindelser på HDAC1 og HDAC6 i celler. Isoform aktivitet måles ved hjælp af ultra-high-performance væskekromatografi-massespektrometri (UHPLC-MS) analyse af specifikke substrater inkuberes med behandlede og ubehandlede HeLa celler. Metoden har fordelen, afspejler den endogene HDAC aktivitet inden for celle-miljøet i modsætning til celle-fri biokemiske analyser udført på isolerede isoformer. Endvidere, fordi den er baseret på kvantitativ bestemmelse af syntetiske substrater, metoden kræver ikke antistof anerkendelse af endogene acetyleret proteiner. Det er let at tilpasse til flere cellelinjer og en automatiseret proces. Metoden har allerede vist sig nyttige i at finde HDAC6-selektiv forbindelser i neuroblasts. Repræsentative resultater er vist her med standard HDAC-hæmmere trichostatin en (ikke-specifik), MS275 (HDAC1-specifik), og tubastatin en (HDAC6-specifik) ved hjælp af HeLa celler.
Introduction
HDAC'er tilhører en familie af enzymer, at deacetylate histoner kromatin struktur. De også har andre protein substrater i cytosol og er placeret i forskellige celle rum. Ialt 18 HDAC isoformer er konstateret indtil nu og har været relateret til flere celle mekanismer, herunder regulering af transkriptionsfaktorer og Gen-ekspression, samt celle signalering og transportere1,2,3,4,5,6,7. Katalytisk HDAC-hæmmere er dukket op som potentielle terapeutiske lægemidler for kræftbehandling. De fleste HDAC-hæmmere i øjeblikket godkendt af FDA er til behandling af T-celle lymfom og myelomatose, og uspecifikke HDAC-hæmmere, såsom vorinostat (SAHA), belinostat og panobinostat8,9. Imidlertid en række bivirkninger er blevet forbundet med pan-hæmmere, og Søg efter isoform-specifikke små molekyler er et varmt emne i medicinsk kemi og drug discovery. Derfor, klassen jeg (HDAC1-3 og HDAC8) selektive hæmmer romidepsin er et allerede godkendt lægemiddel10, mens HDAC6-specifikke hæmmere er i øjeblikket under kliniske forsøg, med øget terapeutiske potentiale i myelomatose11,12,13,14,15.
Screening assays for at karakterisere HDAC er hæmmere baseret på dyrkning af en HDAC bærematerialet med en enzymatisk kilde (enkelt isoform, nukleare ekstrakt eller celle lysate). Underlaget er normalt en lille peptid sekvens indeholdende en acetyl lysin rest koblet til en cleavable fluorophore (fx cumarin), såsom N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. For at skelne mellem isoform-specifikke aktiviteter, separat celle-fri assays involverer hver isoform er nødvendigt og kan ikke afspejle den reelle isoform aktivitet i levende celler. Isoform-specifikke substrater er kommercielt tilgængelige, såsom benzyl (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 særlige substrat) og (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic syre tert-butyl ester (BATCP, HDAC6 særlige substrat) (figur 1B). Dog vil en multi substrat blanding indeholdende MAL, MOCPAC og BATCP givet til levende celler ikke tillade påvisning af de enkelte deacetylated produkter ved fluorometriske måling, eftersom at de er forsynet med den samme cleavable fluorophore.
Metoden beskrevet her giver mulighed for påvisning og relative kvantificering af hver substrat og dens deacetylated produkt i HeLa celler ved hjælp af en multi substrat assay efterfulgt af UHPLC-ESI-MS/MS analyse17. En HDAC assay er udført på HeLa celler at aktivere direkte identifikation af HDAC hæmmende aktivitet og specificitet test tinforbindelser på endogene HDAC'er. Der er fokus på HDAC1 og HDAC6, som evalueres samtidig. For at opnå disse enzymatisk målinger i et enkelt inkubation assay, tilføjes en blanding af uspecifikke og specifikke HDAC substrater behandlede og ubehandlede HeLa celler belagt på en 96-brønd plade. Efter en inkubation trin mængden celler til at frigive substraterne og deres respektive reaktionsprodukter, som er adskilt og påvises ved hjælp af en UHPLC-MS metoden (figur 1 c). De deacetylated produkter MAL, MOCPAC og BATCP underlag er deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) og deacetylated BATCP (dBATCP), henholdsvis. Dosis-respons-kurver kan bygges med aktive forbindelser.
Figur 1: generel ordning for celle-baserede HDAC analysen til at identificere HDAC1 og HDAC6 specifikke hæmmere af UHPLC-MS analyse af flere substrater. (A) ordning af en typisk 96-brønd plade der indeholder behandlet (test forbindelser) og ubehandlet (kontrol) HeLa celler samt celle-fri blanks. (B) kemiske struktur af substrater tilføjet som en blanding (21 µM) til at være deacetylated af endogene HDAC'er. (C) typisk UHPLC-MS kromatogrammet viser toppene af de tilføjede substrater (MAL, MOCPAC og BATCP) og deres deacetylated produkter (dMAL, dMOCPAC, og dBACTP, henholdsvis). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur
Bemærk: Følgende trin er udført i en standard vævskultur hætte. Fortrolighed med steril teknik forventes.
- Kultur HeLa celler til 80% confluency i en T75 celle kultur kolbe i MEM suppleret med 10% føtal bovint serum, penicillin G (100 U/mL), og streptomycin (100 mg/mL).
Bemærk: Celle kultur, behandling og lysis trin er gennemført under laminar flow, med celle inkubation trin ved 37 ° C udført i en fugtig atmosfære i 5% CO2 under sterile forhold. - Cellerne vaskes to gange med 5 mL af DPBS, Opsug DPBS, og der tilsættes 1 mL af celle dissociation reagens. Der inkuberes ved 37 ° C i 5 min at løsrive cellerne.
- Tilføje 9 mL af MEM næringssubstrat, grundigt resuspend cellesuspension, og tælle de celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Juster tætheden af cellesuspension til 6 x 104 celler/mL i MEM.
- Tilføje 100 µL af cellesuspension til kontrol og teste wells af en steril, flad bund, væv kultur-behandlede 96-brønd plade (figur 1A).
- Tilføj 100 µL af MEM næringssubstratet Tom brønde af 96-brønd plade (figur 1A).
- Inkuber 96-brønd pladen ved 37 ° C i 24 timer.
Bemærk: En 24 h inkubation er en passende tid til at teste for endogene HDAC aktivitet i HeLa celler. Forskellige celletyper med ukendt HDAC aktivitet muligvis en timecourse evaluering af kontrol celler.
2. celle behandling med Test forbindelser og HDAC substrater
- Opsug medium fra brønde i 96-brønd-pladen.
- Tilsæt 25 µL af 2 x test forbindelser (fx trichostatin A, MS275 og tubastatin A) i MEM at teste brønde. Tilføje 25 µL af MEM til kontrol og Tom brønde.
Bemærk: Koncentrationen af test forbindelser er skal justeres for at give en vifte af mindst 5 endelige test-koncentrationer (én koncentration pr. brønd). DMSO endelige koncentration i den sammensatte prøve må ikke overstige 0,5% og bør være den samme i hver brønd, herunder tomme og kontrol. Den endelige inkubation volumen er 50 µL pr. brønd. Trichostatin A er testet på 5 koncentrationer spænder fra 500 til 1,95 nM (1:4 fortynding). MS275 og tubastatin A testes på 5 koncentrationer spænder fra 8.000 til 6.17 nM (1:6 fortynding). Ønskede endelige test-koncentrationen for hver test sammensatte bør fastsættes af hver enkelt bruger ved at oprette en dosis-respons kurve. - Tilføj 25 µL af substrat blanding (42 µM MAL, 42 µM af MOCPAC og 42 µM af BATCP i MEM) kontrol og test brønde. Tilføj 25 µL af MEM Tom brønde.
NOTE: Den endelige koncentration af hver substrat er 21 µM. MOCPAC og BATCP skelne mellem HDAC1 og HDAC6 aktivitet, henholdsvis (figur 1B). Når ingen aktivitet er observeret med disse substrater, kan brugen af MAL potentielt føre til identifikation af aktivitet mod en anden HDAC isoform. - Inkuber 96-brønd pladen ved 37 ° C i 8 timer i en fugtig 5% CO2 inkubator.
Bemærk: Denne Inkubationstiden er velegnet til HeLa celler og tillader den endogene HDAC at interagere med de syntetiske substrater. Forskellige cellelinjer kan kræve justeringer i inkubation tid og/eller substrat koncentration.
3. celle Lysis og prøveforberedelse til UHPLC-ESI-MS/MS
Forsigtig: Prøve forberedelsestrin bruge organiske kemikalier, der er meget brandfarlige og giftig ved indtagelse eller indånding. Bære passende personlig beskyttelse, såsom handsker og sikkerhedsbriller.
- Tilsæt 10 µL af 6 x RIPA buffer (fortyndet fra 10 x RIPA buffer) suppleret med protease inhibitor til hvert hul i 96-brønd plade.
- Reaktionen standses ved at tilføje 160 µL koldt acetonitril til hver brønd og mix af pipettering op og ned.
Bemærk: Hold acetonitril ved-20 ° C før dette trin. - Pladen anbringes i et-80 ° C fryser i 10 min.
- Fjerne pladen fra fryseren og overføre 220 µL af indholdet af hver brønd til en ikke-sterile, konisk bund (V-bund) 96-brønd plade. Der centrifugeres plade på 5.000 x g og 4 ° C i 10 min.
Bemærk: Dette trin tager sigte på at fjerne proteiner og salte. Hvis det er nødvendigt, kan løsningerne overført til individuelle konisk centrifugeglas inden centrifugering eller filtreres gennem et sæt af 96-brønd, 0,65 µm PVDF filter plader. Vellykket fjernelse af bundfaldet er nødvendig før UHPLC analyse. - Overføre 200 µL af supernatanten (eller filtratet) til en 96-brønd plade kompatibel med UHPLC system og forsegle det med fastgøres aftrækkelige, Varmforsegling folie ved hjælp af en plade sealer.
Bemærk: Undgå pipettering pellets, når du fjerner analysere. Hvis UHPLC analyse ikke kan udføres øjeblikkeligt, kan pladen opbevares ved 4 ° C i højst 24 timer indtil analyse.
4. UHPLC/MS-MS analyse
- Forberede UHPLC system ved at udfylde det med den mobile fase system (95% A:5% B):
A: H2O, HPLC-renhed, der indeholder 0,1% myresyre (forberede 1 L)
B: acetonitril, HPLC-renhed, der indeholder 0,1% myresyre (forberede 1 L).
Advarsel: Den mobile fase indeholder organiske kemikalier, der er meget brandfarlige og giftig ved indtagelse eller indånding. Bære passende personlig beskyttelse, såsom handsker og sikkerhedsbriller. - 96-brønd pladen anbringes i stikprøven manager indeholder en plade holder. Køre prøveeksemplarer efter de UHPLC-ESI-MS/MS betingelser i tabel 1.
Bemærk: Hver kolonne i den analytiske 96-brønd plade bør have ét kontrolelement godt og en blindprøvebrønd, (som afbildet i ordningen plade af figur 1A). Kontrol er repræsentant for 100% enzymatisk aktivitet i den testede cellelinie, mens blanks er der til at kontrollere, om MS kilde giver ensartet baggrund. Usædvanlige MS toppe opdaget i en given Tom bør undersøges for at forhindre MS følsomhed ændringer.
5. dataanalyse
- Integrere toparealet for hver substrat og dens deacetylated produkt med en passende UHPLC integration software.
Bemærk: Brug automatisk integration parametre med en udjævning metode (middelværdi, rude nummer 3 og antallet af glat 2, for eksempel). Bruger de chromatografiske betingelser i tabel 1, er eluering ordre dMAL (5,8 min), dBATCP (6,0 min), dMOCPAC (6,2 min), MAL (7,6 min), MOCPAC (8.9 min) og BATCP (9,8 min), som afbilledet i figur 1 c. - Hver substrat, beregning af forholdet mellem toparealerne (deacetylated/acetyleret) i hvert kromatogram (test og kontrol prøver).
- Beregn den procentvise HDAC-hæmning af hver prøve:
Bemærk: HDAC1 hæmning beregnes ved hjælp af forholdet mellem toparealerne for dMOCPAC/MOCPAC; HDAC6 hæmning beregnes med dBATCP/BATCP. Forholdet dMAL/MAL kan bruges til at udtrykke almindelige HDAC-hæmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At dokumentere metoden anvendes til identifikation af non-selektive og selektive hæmmere for HDAC1 (klasse I) og HDAC6 (klasse IIb), HeLa celler blev behandlet med kendte standard forbindelser: trichostatin A (non-selektive mellem HDAC1 og HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selektiv hæmmer)19og tubastatin en (HDAC6-selektiv hæmmer)20. Ved hjælp af den nuværende metode (figur 1), IC50 værdier kan fastsættes direkte i levende celler for HDAC1 (ved at kigge på MOCPAC deacetylation) og HDAC6 (ved at kigge på BATCP deacetylation) (figur 2). Trichostatin A var en potent men non-selektive hæmmer mod HDAC1 og HDAC6. På den anden side var MS275 selektiv for HDAC1, mens tubastatin A var tydeligvis selektiv for HDAC6.
Figur 2: IC50 dosis-respons kurver samtidigt opnås HDAC1 og HDAC6 af tre standard HDAC-hæmmere: de non-selektive trichostatin A, den HDAC1-selektive MS275 og den HDAC6-selektive tubastatin A. IC50 værdier præsenteret i tabellen tilstødende er den gennemsnit ± SD af tre uafhængige målinger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Injektionsvolumen | 5 ΜL |
| Kolonne | C18 (2,6 μm, 100 mm x 3 mm i.d.) |
| Kolonne temperatur | 40 ° C |
| Eluering strømningshastighed | 0,8 mL/min. (typisk trykområde: 400-600 barer) |
| Eluering gradient | 5-45% B i 10 min |
| 45-98% B i 2 min | |
| Vaske trin | 98% B for 2 min |
| Equilibrating skridt | 5% B for 4 min |
| ESI-MS/MS | kegle spænding, 30 V; kapillar source spænding, 3,0 kV; kapillar temperatur, 350 ° C; kilde temperatur, 120 ° C; kappe gas - kvælstof (600 L/h); kollision gastryk, argon sat til 3 x 10-3 mbar |
| Kollision parametre og reaktion kanaler optimeret med en hviletid på 0,1 s, 0,01 s interscan forsinkelser og kollisionen energi sat til 20 eV. | |
| MAL detection med masse overgange 446 → 346 (MAL) og 404 → 304 (dMAL). | |
| MOCPAC registrering med masse overgange 494 → 449 (MOCPAC) og 439 → 394 (dMOCPAC). | |
| BATCP registrering med masse overgange 500 → 400 (BATCP) og 476 → 376 (dBATCP). |
Tabel 1: UHPLC-ESI-MS/MS betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HDAC-hæmning er et varmt emne i drug discovery, med aktuelle fokus på HDAC6-selektiv hæmmere for kræft terapi21. HDAC selektivitet vurderes normalt af en serie af høj overførselshastighed, celle-gratis assays, som har til hensigt at fastslå de hæmmende potens mod individuelle HDAC isoformer21. Dog af en inhibitor selektivitet skal desuden bekræftes i levende celler ved at evaluere acetylation status af endogene protein substrater, såsom histoner (for klasse I HDAC'er) og tubulin (for HDAC6). Derfor, celle assays involverer antistof anerkendelse (fx immunfarvning, vestlige skamplet, flowcytometri og ELISA) er normalt nødvendigt for at opnå en kvantitative eller semi-kvantitative evaluering af isoform potens af et givet stof i levende celler,21. Det er ikke sjældent, at et stof, der var selektiv i en celle-fri enzymatisk analyse viser sig for at være ikke-selektiv i celler eller væv17,22, og vice versa19. Dette kan forklares ved forskelle i ikke-standardiseret enzymatisk kilder og fraværet af co-faktorer eller protein partnere i biokemiske assays21.
Metoden beskrevet her er en hurtig, antistof-gratis alternativ giver mulighed for direkte måling af klasse I (HDAC1) og klasse IIb (HDAC6) hæmmende styrke i levende celle miljø17. En anden fordel ved metoden er, at det kan let tilpasses til forskellige cellelinjer, såsom neuroblasts23, med mulighed for miniaturisering og automatisering, som tidligere beskrevet for andre celle-baserede assays24. Påvisning af specifikke substrater af massespektrometri bidrager til nøjagtig måling af de deacetylated produkter, giver tilsvarende kvantitative resultater. Dette er den første metode til bestemmelse af IC50 værdier mod specifikke HDAC isoformer i levende celler. Snarest sammenligningen, den ikke-kvantitative selektive profil af HDAC-hæmmere observeret af vestlige skamplet har påvist at være i overensstemmelse med profilen selektiviteten opnået med metoden beskrevet her17. Selvom denne metode er blevet udviklet til opdagelsen af nye klasse-selektiv HDAC-hæmmere, kunne den også anvendes til at måle HDAC aktivitet inden for cell modeller i løbet af en sygdom. Dette kunne bidrage til udredning af epigenetiske og molekylære mekanismer i relevante sygdomme og potentielt kunne identificere lægemiddelkandidater. Ekstrapolere denne metode mod HDAC isoformer end HDAC1 og HDAC6, er udvikling af nye selektive HDAC substrater stærkt opmuntret. Desuden bør substrat specificiteten af MOCPAC og BATCP være fuldt karakteriseret med hensyn til målretning enkelt isoformer. Faktisk, mens MOCPAC er klassificeret som en HDAC1-specifikke substrat (klasse I løbet af klasse II), det er mere sandsynligt, at det er en generisk klasse substrat (herunder HDAC3 isoform), som tidligere påvist25. BATCP er derfor et kendt HDAC6-selektive substrat (klasse II over klasse I HDAC'er), men dets specificitet mod andre klasse II HDAC'er, såsom HDAC4, fortjener yderligere karakterisering25.
Enzymaktivitet kan variere afhængigt af cellelinie, celle nummer, confluency og inkubering tid. Når en cellelinje bruges for første gang i analysen, er det vigtigt at teste en række substrat koncentrationer i kontrol celler, på forskellige tidspunkter, at analysere enzymkinetik af UHPLC-MS (f.eks. gennem en Michaelis-Menten plot). Dette vil gøre det muligt forskerne til at vælge den bedst egnede inkubation tid og substrat koncentration. Dette valg er baseret på to vigtige parametre: 1) enzymkinetik og 2) påvisning af substraterne og deres deacetylated produkter. Når du analyserer enzymkinetik, det er vigtigt at vurdere de indledende hastighed værdier (dvs. når produkt dannelsen er inden for det lineære område) til at etablere enzymkinetik. Ifølge kinetik, skal substrat koncentrationer under Km vælges til at give en præcis procentdel af hæmning, især i forbindelse med konkurrencedygtige og konkurrencedygtige hæmmere26. På den anden side bør den valgte substratkoncentrationen levere påviselige og kvantificerbare MS signaler til både substrat og deacetylated produkt (signal-støj-forholdet ≥20)17. Når du bruger flere substrater, bør metoden kromatografiske sikrer adskillelse af alle toppe der skal analyseres. Alternative kromatografiske systemer kan kræve ændringer i adskillelse gradient og kolonnen type.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender COST Action CM1406 (epigenetiske kemisk biologi). Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af instituttets Pierre Mercier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Trichostatin A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Tubastatin A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Formic acid, LC/MS grade | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, HPLC grade | distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system | ||
| HeLa cells | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Cell dissociation reagent TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, cell culture grade | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA buffer | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning | VWR | 29442-404 | used in the centrifugation step |
| 96-well plate, conical bottom, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | compatible with the Acquity UHPLC system |
| T75 cell culture flasks Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Peelable heat sealing foil | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC system | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Integration software: MassLynx V4.1 | Waters | Catalog number not available | |
| Combi thermo-sealer SP-0669/240 | Waters | Catalog number not available | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Waters | Catalog number not available |
References
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
- Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
- Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
- Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
- Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
- Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
- Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
- Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012).
- U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013).
- U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015).
- Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
- Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).
- Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
- Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
- Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
- Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
- Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. Sippl, W., Jung, M. , Wiley-VCH. (2010).
- Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
- Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
- Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
- Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
- Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , Wiley. (2005).
