Un test immunologique capillaire-basé utilisant une plate-forme commerciale pour mesurer les protéines cibles des préparations de protéines totales est démontré. En outre, les paramètres de dosage des temps d’exposition et la concentration de protéines et l’affaiblissement de l’anticorps sont optimisés pour un système de modèle de culture cellulaire.
Nouvelles technologies qui utilisent immunologiques capillaire promettent évaluation plus rapide et plus quantitative des protéines par rapport aux traditionnels tests immunologiques. Cependant, semblable aux autres tests de protéine à base d’anticorps, optimisation des paramètres de base capillaire immunologique, comme la concentration de protéines, dilution de l’anticorps et durée d’exposition est une condition importante pour la génération de significatif et fiable données. Les mesures doivent entrer dans la gamme linéaire du dosage où les changements du signal sont directement proportionnelles aux variations de concentration de lysate. Le processus de choix des concentrations appropriées de lysats, dilutions d’anticorps et temps d’exposition à la ligne de cellules épithéliales bronchiques humaines, BEAS-2 b, est démontré ici. Linéarité de dosage est indiquée sur une plage de concentrations de protéines extrait de cellules entières avec les anticorps p53 et α-tubuline. Un exemple de burnout signal est observé aux concentrations maximales avec longs temps d’exposition, et une courbe de dilution des anticorps α-tubuline est montrée démontrant la saturation. En outre, les résultats expérimentaux exemple sont rapportés pour cellules traités à la doxorubicine en utilisant des paramètres optimisés.
Les immunoessais électrophorèse capillaires mesurent l’expression de la protéine dans les lysats cellulaires à l’aide de systèmes de séparation de taille ou de la charge et offrent plusieurs avantages sur les immuno-essais traditionnels. Par exemple, par rapport à la tache occidentale, la procédure de base capillaire automatisée élimine le besoin pour les gels, les dispositifs de transfert, et manuel se lave. En outre, la quantité absolue de protéine nécessaire est environ 10 fois inférieure, rendant les systèmes axés sur le capillaire idéal pour être utilisé avec les types de cellules rares ou échantillon limité1,2. Résultats sont obtenus en moins de 3 h à l’aide de systèmes automatisés et précédemment se sont avérées plus quantitative et plus reproductible qu’occidentale conventionnelle blot procédures3,4,5. Le processus pour les analyses basées sur la taille consiste à charger des échantillons contenant de dodécyl sulfate de sodium (SDS), le dithiothréitol (DTT) et fluorescent étiqueté des marqueurs de poids moléculaire dans des colonnes capillaires contenant des matrices d’empilage et de séparation. La tension appliquée aux capillaires sépare les protéines dans les échantillons selon la taille, et lumière UV permet d’immobiliser les protéines séparées à la paroi capillaire. Le capillaire est ensuite immuno-sondés avec spécifique à la cible primaire anticorps et raifort peroxydase (HRP)-anticorps secondaire conjugué. Luminol et peroxyde catalysent chimiluminescente génération léger qui est mesurée par une caméra de dispositif couplé (DAC) frais et analyse pour doser les protéines.
Malgré la relative facilité et la vitesse d’une plate-forme de test immunologique électrophorétique axée sur le capillaire automatisée, optimisation des conditions de test comme la concentration de protéines, dilution de l’anticorps et durée d’exposition est importante pour l’obtention de précis et reproductibles résultats. En général, les procédures suivantes doivent être exécutées pour optimiser un test pour ces systèmes :
1) un écran doit être effectué pour évaluer et choisir des anticorps pour le signal et la spécificité de la cible de la protéine. Le cas échéant, protéine purifiée ou épitope de la cible peut être utilisé pour évaluer la spécificité ; Toutefois, il est toujours important d’évaluer le potentiel signal non spécifique en protéines totales provenant du système de modèle.
2) ensuite, la gamme dynamique du dosage doit être déterminé. Dans une situation idéale, signal doublement (mesurée à l’aide de la surface du PIC) est observé que la concentration de l’échantillon est doublée ; Cependant, en pratique, un changement proportionnel de signal à l’entrée d’une manière prévisible (par exemple, linéaire s’adapter) est suffisant pour la quantification des protéines. En outre, cette optimisation définira la concentration de protéines avec signal élevé mais toujours dans la gamme linéaire pour le modèle expérimental.
3) déterminer la concentration en anticorps optimale à l’aide de la concentration de protéine fixe choisie à l’étape d’optimisation 2. Comme la concentration en anticorps augmente, le signal augmente jusqu’à ce qu’il des plateaux à saturation. Une concentration d’anticorps près de ce niveau de saturation est requise pour la mesure précise de la concentration de protéines.
Le processus utilisé pour optimiser les concentrations de protéine, dilutions des anticorps et des temps d’exposition pour un dosage de taille de base capillaire automatisée6 est démontré en utilisant des extraits de cellules entières isolées de BEAS-2 b, un homme de SV-40 transformé bronchique lignée de cellules épithéliales. Isolement des protéines dans des extraits cellulaires ou tissulaires peut être effectuée à l’aide d’un certain nombre de protocoles publiés7,8,9 et n’est pas couverts ici. Résultats d’une expérience de première instance à l’aide des conditions optimisées sont également signalés pour total et phosphorylées p53 (sérine 15, sérine 20) dans les cultures exposées à la doxorubicine (un agent chimiothérapeutique commun qui induit l’apoptose de cellules10) à 1.2, 1.8, et 2,4 µg/mL de milieu de pendant 4 h avant la récolte. La surface des pics p53 sont normalisées à ɑ-tubuline, qui est utilisée comme un contrôle de chargement.
Pendant des décennies, il y a eu un intérêt soutenu dans le développement de méthodes d’immuno-essai axée sur électrophorèse capillaire en raison de la faible échantillon et réactif des dépenses, a diminué de traitement temps par rapport aux méthodes traditionnelles et de haute compatibilité avec automatiser la procédure4,15. Il y a un certain nombre de différents protocoles pour la séparation des protéines qui ont utilisé des capillaires, y compris les polymères électrophorétique, électrocinétique, tamisage et méthodes isoélectriques, qui isolent les protéines par des propriétés différentes (respectivement, charge électrostatique, équilibre de partition, tamisage des propriétés de la matrice de séparation et le pH)16. Nous décrivons ici une base d’anticorps (ou immunologique) méthode de l’électrophorèse capillaire, utilisant un polymère tamisage de séparation, qui a été automatisée et commercialement adopté3. Avantages de ce système sont la facilité d’utilisation et de fonctionnement, réactifs standardisés et disponibles dans le commerce et des mesures fiables et sensibles qui nécessitent moins réactifs et des échantillons par rapport à des tests de protéine traditionnels comme la tache occidentale, immuno-et autres formats de3,4,5. Il a été noté dans les évaluations précédentes de cette technologie que la gamme de taille de protéines pouvant être évalués ont été limitée par la séparation disponible matrice4, cependant ces dernières offres ont élargi la plage de mesure de 2 à 440 kDa17 . En outre, certains tampons lysats sont connus pour être incompatible avec le dosage18, donc sélection des réactifs expérimentales utilisé doit être considérée au préalable.
Un avantage majeur d’une procédure automatisée avec les composants disponibles dans le commerce est la cohérence des résultats par le biais de méthodes normalisées et réactifs. Cela minimise les chances d’échec de test grâce à l’automatisation des étapes cruciales dans la procédure. Cependant, il est important de noter que certaines pratiques doivent être respectées pendant le protocole afin de minimiser les problèmes avec l’immunodosage axée sur électrophorèse capillaire. Tout d’abord, il est essentiel que le mélange de luminol-S/peroxyde est préparé frais et immédiatement avant la plaque de chargement. Calendrier cohérent se traduira par luminescence conforme après que l’agent oxydant est ajouté, ce qui se traduira par des mesures cohérentes pour un dosage des anticorps après essai. En outre, il est important que les réactifs non expirés sont utilisés, qui touche principalement l’activité de l’agent oxydant. En outre, il est important que l’ordre de chargement des échantillons, des anticorps et autres réactifs être strictement respectées (voir Figure 1). Tout réactif éjectant hors de propos se traduira par l’échec de test et une course perdue.
En plus de ces étapes critiques, des émissions initiales rencontrées avec la technique peuvent généralement être surmontées grâce à l’optimisation. En effet, ces conditions sont spécifiques à chaque combinaison de système/anticorps modèle et devraient donc être déterminées empiriquement pour chaque nouvelle série de tests. Dans cet article, nous nous concentrons sur trois procédures d’optimisation communes : temps d’exposition et titrage lysat et l’affaiblissement de l’anticorps primaire. La capacité de générer des résultats mesurables dépend de l’analyse d’un temps d’exposition lorsque le substrat de luminol n’est pas être rapidement épuisé, comme substrat appauvrissement entraîne perte de signal. Titrage lysat détermine la plage dynamique linéaire de chaque série de tests, qui peut différer avec systèmes différents modèles, ainsi que des anticorps différents, même pour la même cible de protéine. Les dilutions d’anticorps choisies à ou près de concentrations saturantes assurer changements de signal ne seront pas affectés par une pénurie d’anticorps libres, mais seulement par une quantité différente de protéine disponibles cible épitope. Autres considérations au cours du processus d’optimisation peuvent inclure des temps d’incubation anticorps et empiler les temps de chargement/échantillon. Dans la plupart des cas, les paramètres par défaut pour l’instrument offrent le meilleur équilibre de la résolution et la sensibilité. Cependant, dans certains cas, faible résolution ou sensibilité peut être améliorée en ajustant ces paramètres.
Méthodes d’immuno-essai axée sur électrophorèse capillaire fournissent des mesures de protéine rapide, efficace et reproductible. Bien que ces méthodes ont été principalement utilisés dans les milieux de recherche et développement, la cohérence de ces technologies a utilité potentielle dans les applications cliniques et réglementaires. Par exemple, l’identification des sous-populations sensibles aux substances toxiques environnementales ou de patients avec progression de la maladie peut reposer sur les biomarqueurs protéiques mesurées dans des matrices accessibles, comme sang, urine et salive. Comme réactif et chute de coûts de fonctionnement et le nombre d’échantillons et des cibles qui peuvent être mises en recouvrement en même temps augmente, nous verrons probablement les méthodes immuno-essai axée sur électrophorèse capillaire utilisés pour ces types d’applications.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Keith Tarpley nous EPA du Bureau de l’équipe recherche et développement-Research Triangle Park (RTP-ORD) graphique et des médias pour le développement, enregistrement et montage de la vidéo d’instruction. Nous tenons également à remercier Deborah Pritchett de ProteinSimple pour les conversations utiles au sujet de l’optimisation de nos données,. JM Guynn a été soutenu par l’Institut d’Oak Ridge pour la Science et l’éducation programme de recherche/Participation à la US Environmental Protection Agency.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |