Hedef proteinler üzerinden toplam protein ürünleri ölçmek için bir ticari platformu kullanarak bir kılcal tabanlı immunoassay gösterilmiştir. Buna ek olarak, pozlama süresi, protein konsantrasyonu ve antikor seyreltme tahlil parametreleri bir hücre kültür modeli sistemi için optimize edilmiştir.
Uzun kılcal tabanlı kullanmak yeni teknolojiler için geleneksel uzun kıyasla daha hızlı ve daha nicel protein değerlendirme söz veriyorum. Ancak, benzer şekilde diğer protein antikoru tabanlı deneyleri, protein konsantrasyonu, antikor seyreltme ve çekim hızı gibi kılcal tabanlı immunoassay parametrelerinin Optimizasyonu önemli bir anlamlı ve güvenilir nesil önkoşuldur veri. Ölçümleri sinyal değişiklikleri lysate konsantrasyon değişiklikleri doğrudan orantılı nerede tahlil doğrusal aralık içinde olmalıdır. Uygun lysate konsantrasyonları, antikor dilutions ve pozlama süreleri insan bronş epitel hücre hat, BEAS-2B, seçme işlemi burada gösterilmiştir. Tahlil doğrusallık tüm cep telefonu özü protein konsantrasyonları p53 ve α-tübülin antikorları ile bir dizi üzerinden gösterilir. Sinyal tükenmişlik örneği uzun pozlama süreleri ile en yüksek konsantrasyonlarda görülür ve doygunluk gösteren bir α-tübülin antikor seyreltme eğrisi gösterilir. Ayrıca, örnek deneysel sonuçlar en iyi duruma getirilmiş parametrelerini kullanarak doksorubisin tedavi hücreler için raporlanır.
Kapiler elektroforetik uzun boyutu veya şarj ayırma sistemleri kullanarak hücre lysates ifadede protein ölçmek ve geleneksel uzun çeşitli avantajlar sağlar. Örneğin, Batı leke için karşılaştırıldığında, kılcal tabanlı otomatik işlemleri jelleri, aktarım cihazları, gereksinimini ortadan kaldırır ve manuel yıkar. Buna ek olarak, mutlak gerekli protein yaklaşık 10 kat daha az, kılcal tabanlı sistemler nadir hücre tipleri veya sınırlı örnek1,2ile kullanmak için idealdir miktarıdır. Sonuçlar az 3 h otomatik sistemler kullanarak olarak elde edilen ve daha önce daha nicel ve geleneksel Batı daha tekrarlanabilir gösterilmiştir yordamlar3,4,5leke. Işlem boyutu tabanlı deneyleri için Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), dithiothreitol (DTT), içeren örnekleri yükleme oluşur ve fluorescently molekül ağırlığı işaretleri istifleme ve ayırma matrisler içeren kapiller sütunlara etiketli. Kılcal damarlar için uygulanan gerilim büyüklüğüne göre örneklerinde proteinler ayırır ve UV ışığı kapiller duvarı için ayrılmış proteinlerin immobilizes. Kılcal sonra IMMUNO probed-hedef özgü birincil antikor ve horseradish peroksidaz ile (HRP)-konjüge ikincil antikor. Luminol ve peroksit bir ücret eşleşmiş cihaz (CCD) kamera tarafından ölçülen ve protein quantitate için analiz chemiluminescent ışık nesil katalizler.
Göreli kolaylık ve hız bir kılcal tabanlı otomatik elektroforetik immunoassay platformu rağmen tahlil koşulları protein konsantrasyonu, antikor seyreltme ve çekim hızı gibi duruma getirilmesi doğru tekrarlanabilir elde etmek için önemlidir sonuçlar. Genel olarak, bir tahlil bu sistemler için en iyi duruma getirmek için aşağıdaki yordamları yapılmalıdır:
1) bir ekran değerlendirmek ve antikorlar sinyal ve özgüllük protein hedef seçmek için yapılmalıdır. Varsa, saf protein veya hedef epitope özgüllük değerlendirmek için kullanılabilir; Ancak, toplam protein modeli sisteminden kaynaklı olası belirsiz sinyal değerlendirmek hala önemlidir.
2) sonra tahlil dinamik aralığını belirlenmesi gerekiyor. Örnek toplama iki katına gibi ideal bir sinyal (pik alanı kullanarak ölçülen) iki katına görülmektedir; Ancak, uygulamada, tahmin edilebilir bir şekilde (uygunörneğin, doğrusal) giriş için sinyal orantılı bir değişiklik protein miktar için yeterlidir. Ayrıca, bu iyileştirme protein konsantrasyonu yüksek sinyal ile ama hala deneysel model için doğrusal aralık içinde tanımlayabilirsiniz.
3) en iyi duruma getirme adım 2’de seçilen sabit protein konsantrasyonu kullanarak en uygun antikor konsantrasyonu belirlemek. Antikor konsantrasyonu artırır, sinyal o doygunluk yaylalar kadar artar. Bu doygunluk düzeyi yakınındaki bir antikor konsantrasyonu protein konsantrasyonu doğru ölçüm için gereklidir.
Protein konsantrasyonları, antikor dilutions ve pozlama süreleri bir kılcal tabanlı otomatik boyut tahlil6 için en iyi duruma getirmek için kullandığı işlem bütün hücre özleri BEAS-2B bir SV-40 dönüştürülmüş insan bronş izole kullanarak gösterilmiştir epitel hücre satırı. Hücre veya doku özleri protein izolasyon çok sayıda yayımlanan protokolleri7,8,9 kullanarak gerçekleştirilebilir ve burada yer almaz. En iyi duruma getirilmiş koşullar kullanarak bir deneme deneme sonuçlarını da için toplam bildirdi ve fosforile (serin 15, serin 20) p53 1,2, doksorubisin (hücre apoptosis10ikna bir ortak kemoterapötik Ajan) maruz kültürlerde 1.8, ve 2.4 µg/mL medya 4 hasat öncesinde s için. P53 en yüksek alanlarda yükleme denetimi olarak kullanılan ɑ-tübülin için normalleştirilmiş.
On yıllardır, oldu sürekli Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntem geliştirme ilgi işleme azalmıştır düşük örnek ve reaktif harcamaları nedeniyle, zaman zaman geleneksel yöntemlere göre ve yüksek uyumluluk için yordam4,15otomatikleştirmek. Kılcal damarlar, elektroforetik, electrokinetic, polimer eleme ve proteinler (sırasıyla farklı özelliklerine göre ayır, isoelectric yöntemleri de dahil olmak üzere kullanılan proteinler ayrılması için farklı iletişim kuralları vardır Elektrostatik yükü, bölüm denge, özellikleri ayıran matris ve pH eleme)16. Burada, bir otomatik ayırma, eleme bir polimer kullanarak antikor tabanlı (veya immunoassay) Kapiler elektroforez yöntemi ve ticari olarak kabul edilen3açıklayın. Bu sistemin avantajları kolaylığı kullanım ve işlem, standart ve piyasada bulunan reaktifler ve daha az reaktif ve geleneksel protein deneyleri Batı leke gibi karşılaştırıldığında örnekleri gerektirir güvenilir, duyarlı ölçümler şunlardır, enzim bağlı immunoassay ve diğer formatları3,4,5. O bu teknoloji önceki Değerlendirmeler içinde değerlendirilebilir protein boyutu aralığı tarafından kullanılabilir ayırma matris4ancak son teklifleri için 440 kDa17 2 Aralık ölçülebilir genişlettik, sınırlı dikkat edilmiştir . Buna ek olarak, bazı lysate arabellekleri tahlil18ile uyumsuz olduğu bilinmektedir, bu nedenle kullanılan deneysel reaktifler yelpazesi önceden dikkate alınmalıdır.
Bir otomatik işlemi piyasada bulunan bileşenleri ile önemli bir avantajı standartlaştırılmış yöntemler ve Kimyasalları ile sonuç tutarlılığını var. Bu tahlil başarısızlık yordam içinde kritik adımlar otomatikleştirerek bozmasını önler. Ancak, bazı uygulamalar için Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay sorunları en aza indirmek için protokol sırasında yapıştırılır gerekir olduğunu unutmamak gerekir. İlk olarak, bu luminol-S/peroksit karışımı taze ve hemen önce yükleme plakası hazırlanır önemlidir. Oksitleyici Ajan, sonra tahlil belirli antikor tayini için tutarlı ölçümleri ile sonuçlanır eklendikten sonra tutarlı zamanlama içinde tutarlı ışıldama neden olur. Ayrıca, süresi bitmemiş reaktifler, hangi öncelikle oksitleyici Ajan potens etkiler kullanılır önemlidir. Ayrıca, örnekleri, antikorlar ve diğer Kimyasalları yükleme sırasını kesinlikle (bkz. şekil 1) takip edilmesi önemlidir. Yersiz pipetted herhangi bir reaktif tahlil başarısızlık ve boşa koşmak sonuçlanır.
Kritik adımları yanı sıra, birincil sorunları tekniği ile deneyimli genellikle optimizasyon ile aşılabilir. Nitekim, bu koşullar her modeli sistem/antikor birleşimi için özeldir ve bu nedenle ampirik olarak her yeni tahlil için tespit edilmelidir. Bu makalede, biz üç ortak en iyi duruma getirme yordamı üzerinde odaklanmak: çekim hızı, lysate titrasyon ve birincil antikor seyreltme. Ne zaman luminol substrat hızla, substrat tükenmesi sonuçlarına sinyal kaybı tükenmiştir değil bir çekim hızı analizini ölçülebilir sonuçlar oluşturma yeteneği bağlıdır. Lysate titrasyon farklı model sistemleri, hem de aynı protein hedef için bile farklı antikorlar ile farklı olabilir her tahlil doğrusal dinamik aralığını belirler. Antikor dilutions veya konsantrasyonları doyurarak yakınındaki seçilmiş ücretsiz antikor yetersizliğinden, ancak kullanılabilir protein hedef epitope farklı miktarda sadece sinyal değişiklikleri etkilenmeyecektir emin olun. Diğer konuları en iyi duruma getirme işlemi sırasında antikor kuluçka süresi ve istifleme/örnek yükleme süresi içerebilir. Çoğu durumda varsayılan ayarlar için araç en iyi çözünürlük ve hassasiyet dengesini sunuyoruz. Ancak, bazı durumlarda yanlış çözünürlükte veya duyarlılık bu parametreleri ayarlayarak geliştirilebilir.
Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntemleri protein hızlı, verimli ve tekrarlanabilir ölçümler sağlar. Bu yöntemler öncelikle araştırma ve geliştirme ayarlarında kullanılan iken, bu teknolojilerin tutarlılık düzenleyici ve klinik uygulamaları potansiyel yarar vardır. Örneğin, duyarlı altgrupları çevre toxicants veya hasta kimlik hastalığın ilerlemesi ile protein biyolojik kan, idrar ve tükürük gibi erişilebilir matrisler ölçülen temel alabilir. Reaktif ve işlem maliyetleri bırak ve örnekleri ve aynı anda biçilen artar olabilir hedeflerin sayısı, biz büyük olasılıkla bu tür uygulamalar için kullanılan Kapiler elektroforetik tabanlı immunoassay yöntemleri göreceksiniz.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Keith Tarpley bize EPA kayıt ve öğretim video düzenleme Office geliştirme, araştırma ve geliştirme-araştırma üçgen Parkı (ORD-RTP) grafik ve medya ekibinin teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Deborah Pritchett ProteinSimple üzerinden bizim veri. duruma getirilmesi ile ilgili yararlı konuşmaları için teşekkür etmek istiyorum JM Guynn bilim ve eğitim araştırma/katılım programı ABD Çevre Koruma Kurumu, Oak Ridge Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |