En kapillær-baseret immunassay ved hjælp af en kommerciel platform til at måle mål proteiner fra total protein præparater er påvist. Derudover er assay parametre eksponeringstid, proteinkoncentration og antistof fortynding optimeret til en celle kultur modelsystem.
Nye teknologier, der udnytter kapillær-baserede immunassays lover hurtigere og mere kvantitativ protein vurdering i forhold til traditionelle immunassays. Men i lighed med andre antistof-baseret protein assays, optimering af kapillær-baseret immunassay parametre, såsom proteinkoncentration, antistof fortynding og eksponeringstid er en vigtig forudsætning for generation af meningsfulde og pålidelig data. Målingerne skal ligge inden for det lineære område af analysen hvor ændringer i signalet er direkte proportional med ændringer i lysate koncentration. Processen med at vælge passende lysate koncentrationer, antistof fortyndinger og eksponering gange i den menneskelige bronchiale epitelcelle linje, BEAS-2B, er vist her. Assay linearitet er vist over en vifte af hele cellen ekstrakt protein fusioner med p53 og α-tubulin antistoffer. Et eksempel på signal udbrændthed er set ved de højeste koncentrationer med lange eksponeringstider, og en α-tubulin antistof fortynding kurve er vist demonstrerer mætning. Derudover er eksempel eksperimentelle resultater rapporteret for doxorubicin-behandlede celler ved hjælp af optimerede parametre.
Kapillar elektroforese immunassays måle protein udtryk i cellelysater ved hjælp af størrelse eller afgift adskillelse systemer og giver adskillige fordele i forhold til de traditionelle immunassays. For eksempel, når sammenlignet med vestlige skamplet, den automatiserede kapillær-baseret procedure eliminerer behovet for geler, overførsel enheder, og manuel vasker. Desuden, er den absolutte mængde af protein kræves ca 10 gange mindre, hvilket gør kapillær-baserede systemer ideel til brug med sjældne celletyper eller begrænset stikprøve1,2. Resultater er opnået på så lidt som 3 h ved hjælp af automatiserede systemer og har tidligere vist sig for at være mere kvantitative og reproducerbare end konventionelle western duppes procedurer3,4,5. Processen for størrelse-baserede assays består af indlæsning af prøver indeholdende dodecyl natriumsulfat (SDS), dithiothreitol (DTT), og fluorescently hedder molekylvægt markører i kapillær kolonner, der indeholder stabling og adskillelse matricer. Anvendes til kapillærerne spænding adskiller proteiner i prøver efter størrelse, og UV-lys immobiliseres adskilt proteiner til kapillar væggen. Kapillar er derefter immuno-aftestede med target-specifikke primære antistof og peberrod peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret sekundær antistof. Luminol og peroxid katalyserer kemiluminescens lys generation, som er målt ved en afgift koblede enhed (CCD) kamera og analyseres for at kvantificere protein.
Trods den relative lethed og hastighed af en automatiseret kapillær-baserede elektroforese immunassay platform er optimering af assay betingelser såsom proteinkoncentration, antistof fortynding og eksponeringstid vigtig for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater. Generelt er bør følgende procedurer udføres for at optimere en analyse for disse systemer:
1) en skærm bør udføres for at vurdere og vælge antistoffer for signal og specificitet til protein målet. Hvis det er tilgængeligt, kan renset protein eller target epitop bruges til at vurdere specificiteten; dog er det stadig vigtigt at vurdere potentielle ikke-specifikke signal i total protein stammer fra modelsystemet.
2) næste, det dynamiske område af analysen skal bestemmes. I en ideel situation, er signal fordobling (målt ved hjælp af toparealet) observeret som prøve koncentration er fordoblet; men i praksis, en proportional ændring i signal til input på en forudsigelig måde (f.eks.lineær passer) er tilstrækkelig for protein kvantificering. Derudover vil denne optimering definere proteinkoncentration med højt signal men stadig inden for det lineære område for den eksperimentelle model.
3) bestemme optimal antistof koncentrationen ved hjælp af den faste proteinkoncentration valgt i optimering trin 2. Som antistof koncentrationen stiger, øges signalet indtil det plateauer på mætning. Et antistof koncentration i nærheden af denne mætning niveau der kræves nøjagtig måling af proteinkoncentration.
Processen, der bruges til at optimere protein fusioner, antistof fortyndinger og eksponering gange for en automatiseret kapillær-baserede størrelse assay6 påvises ved hjælp af hele cellen ekstrakter isoleret fra BEAS-2B, en SV-40 forvandlet menneskelige bronchiale epitelcelle linje. Protein isolation fra celle- eller vævsdel ekstrakter kan udføres ved hjælp af en række publicerede protokoller7,8,9 og vil ikke blive dækket her. Resultaterne af en retssag eksperiment ved hjælp af optimeret betingelserne er også rapporteret til samlet og fosforyleret (Serin 15, Serin 20) p53 i kulturer udsat for doxorubicin (en fælles kemoterapeutiske agent, der inducerer celle apoptose10) på 1,2, 1.8, og 2.4 µg/mL medier for 4 h før høst. P53 toparealer er normaliseret til ɑ-tubulin, der bruges som en loading kontrol.
I årtier, der har været vedholdende interesse i udviklingen af kapillær elektroforese-baseret immunassay metoder på grund af lav prøve og reagens udgifter, faldt behandling tid i forhold til traditionelle metoder, og høj kompatibilitet til automatisere procedure4,15. Der er en række forskellige protokoller til adskillelse af proteiner, der har udnyttet kapillærer, herunder elektroforese, elektrokinetiske, polymer sigtning og isoelektrisk metoder, som isolerer proteiner af forskellige egenskaber (henholdsvis, elektrostatisk opladning, partition ligevægt, sigtning egenskaber af adskille matrix, og pH)16. Her, beskriver vi et antistof-baseret (eller immunassay) kapillær elektroforese metode, ved hjælp af en polymer sigtning adskillelse, der er blevet automatiseret og kommercielt vedtagne3. Fordele ved dette system omfatter brugervenlighed og drift, standardiseret og kommercielt tilgængelige reagenser, og pålidelig, følsomme målinger, der kræver mindre reagens og prøver i forhold til traditionelle protein assays som vestlige skamplet, enzym-forbundet immunassay, og andre formater3,4,5. Det er blevet bemærket i tidligere vurderinger af denne teknologi, at størrelsesområde for protein, som kan vurderes har været begrænset af den tilgængelige adskillelse matrix4, men de seneste tilbud har udvidet den målbare spænder fra 2 til 440 kDa17 . Derudover skal nogle lysate buffere er kendt for at være uforenelig med assay18, udvalg af de eksperimentelle reagenser derfor på forhånd.
En stor fordel af en automatiseret procedure med kommercielt tilgængelige komponenter er konsekvens af resultater gennem standardiserede metoder og reagenser. Dette minimerer chancerne analysen fejl ved at automatisere kritiske trin i proceduren. Det er dog vigtigt at bemærke, at visse former for praksis skal overholdes under protokol til at minimere problemer med den kapillær elektroforese-baseret immunassay. Første, det er afgørende, at luminol-S/peroxid blandingen er forberedt friske og straks før pladen lastning. Konsekvent timing vil resultere i sammenhængende luminescence efter den oxidationsmiddel er tilføjet, hvilket vil resultere i sammenhængende målinger for et bestemt antistof assay efter assay. Derudover er det vigtigt, at ikke-udløbet reagenser der bruges, som påvirker primært styrken af den oxidationsmiddel. Derudover er det vigtigt, at lastning rækkefølgen af prøver, antistoffer og andre reagenser strengt følges (Se figur 1). Ethvert reagens pipetted malplaceret vil resultere i assay fiasko og en spildt køre.
Udover disse kritiske trin overvindes primære problemer oplevet med teknikken generelt gennem optimering. Disse betingelser er specifikke for hver model system/antistof kombination og derfor bør fastsættes empirisk for hver ny assay. I denne artikel vil vi fokusere på tre fælles optimering procedurer: eksponeringstid, lysate titrering og primære antistof fortynding. Evnen til at skabe målbare resultater afhænger analyse af en eksponeringstid når luminol substrat ikke er at være hurtigt forarmet, som substrat udtynding resulterer i tab af signal. Lysate titrering afgør den lineære dynamiske rækkevidde af hvert assay, som eventuelt kan afvige med forskellige modelsystemer, samt forskellige antistoffer, selv for den samme protein mål. Antistof fortyndinger valgt på eller i nærheden af mætte koncentrationer sikre ændringer i signalet ikke vil blive berørt af en mangel på frie antistof, men kun af forskellige mængden af tilgængelige protein target epitop. Andre overvejelser under optimeringsprocessen kan omfatte antistof inkubationstiden og stabling/prøve loading tid. I de fleste tilfælde tilbyder standardindstillingerne for instrumentet den bedste balance mellem opløsning og følsomhed. Dog i nogle tilfælde, kan dårlig opløsning eller følsomhed forbedres ved at justere disse parametre.
Kapillar elektroforese-baseret immunassay metoder giver hurtig, effektiv og reproducerbare protein målinger. Mens disse metoder har primært været udnyttet i indstillinger for forskning og udvikling, har konsistens af disse teknologier potentielle nytte i lovgivningsmæssige og kliniske applikationer. For eksempel, kan identifikation af modtagelige delpopulationer miljømæssige giftstoffer eller patienter med progression af sygdommen være baseret på protein biomarkører målt i tilgængelige matricer, blod, urin og spyt. Som reagens og drift omkostninger dråbe og antallet af prøver og mål, der kan være samtidig vurderes stiger, vil vi sandsynligvis se kapillær elektroforese-baseret immunassay metoder anvendes til disse typer af applikationer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Keith Tarpley os EPA kontor forskning og udvikling-Research Triangle Park (AEI-RTP) grafik og medier team for udvikling, tape, og redigering af instruktions-video. Vi vil også gerne takke Deborah Pritchett fra ProteinSimple for nyttige samtaler om optimering af vores data. JM Guynn blev støttet af Oak Ridge Institut for videnskab og forskning/deltagelse uddannelsesprogram på den US Environmental Protection Agency.
Wes instrument | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | 004-600 | |
P53 DO-1 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-126 | |
phosphorylated p53 (ser 15) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9286 | |
phosphorylated p53 (ser 20) primary antibody | Cell Signaling Technology | 9287 | |
alpha-tubulin primary antibody | Cell Signaling Technology | 3873 | used as a loading control |
Compass Software | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | provided with the Wes | |
12-230 kDa Master kit | ProteinSimple (Santa Clara, CA) | PS MK02 (since replaced by a new kit #) | |
www.proteinsimple.com/consumables_sw_wes.html | INCLUDES PART NO: Wash Buffer (60 mL) 042-202 10X Sample Buffer (440 μL) 042-195 Pre-Filled Microplates (8) PS-PP01 Capillary Cartridges (8) PS-CC01 Antibody Diluent II (20 mL) 042-203 Luminol-S (1.5 mL) 042-233 Peroxide (1.5 mL) 042-234 Streptavidin-HRP (132 μL) 042-414 Standard Pack (8): Biotinylated ladder, fluorescent 5X master mix, DTT, and empty 0.6 mL tube PS-ST01 Anti-Rabbit Secondary Antibody 042-206 or Anti-Mouse Secondary Antibody 042-205 |
||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell culture, treatment, and harvest (using vendor recommended protocols; protocols not included in manuscript) | |||
BEAS-2B cells | American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) | CRL-9609 | |
keratinocyte growth medium, KGM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192152 | for cell culture |
keratinocyte basal medium, KBM Gold | Lonza Ltd (Basel, Switzerland) | 192151 | serum free medium for chemical dosing |
doxorubicin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | D1515 | |
Coomassie Blue Bradford Assays | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 23200 | for protein quantification |
Nuclear Extract kit | Active Motif (Carlsbad, CA) | D1515 | used to prepare whole cell lysates |
INCLUDES: | |||
Lysis Buffer AM1 | |||
1M dithiothreitol (DTT) | |||
Protease Inhibitor Cocktail | |||
10X PBS | |||
Phosphatase Inhibitors |