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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

UMA Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55939
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Summary

Aqui, apresentamos um ensaio específico de Caenorhabditis elegans projetado para avaliar mudanças no comportamento de aversão ao cobre e a capacidade de localizar uma fonte de alimento comum, à medida que o organismo progride de um estado nutricional bem alimentado para morrer de fome.

Abstract

Para garantir a sobrevivência, os organismos devem ser capazes de evitar habitats desfavoráveis, garantindo uma fonte consistente de alimentos. Caenorhabditis elegans alteram seus padrões de locomotriz após a detecção de diversos estímulos ambientais e podem modular seu conjunto de respostas comportamentais em resposta a condições de fome. Os nemematódios exibem tipicamente uma resposta aversiva diminuída quando removidos de uma fonte de alimento durante mais de 30 min. A observação de mudanças comportamentais em resposta a um estado nutricional em mudança pode fornecer informações sobre os mecanismos que regulam a transição de um estado bem alimentado para um estado de fome.

Nós desenvolvemos um ensaio que mede a capacidade de um nematóide de atravessar uma barreira aversiva ( isto é, cobre) e chegar a uma fonte de alimento durante um período prolongado de tempo. Este protocolo baseia-se no trabalho anterior, integrando múltiplas variáveis ​​de forma a permitir a coleta contínua de dados à medida que os organismos se deslocam para umaN condição cada vez mais fome. Além disso, este ensaio permite um aumento do tamanho da amostra para que populações maiores de nemátodos possam ser avaliadas simultaneamente.

Os organismos defeituosos para a capacidade de detectar ou responder ao cobre imediatamente atravessam a barreira química, enquanto os nemátodos de tipo selvagem são inicialmente repelidos. À medida que os vermes de tipo selvagem estão cada vez mais famintos, eles começam a atravessar a barreira e chegar à fonte de alimento. Nós projetamos este ensaio para avaliar um mutante incapaz de responder a diferentes pistas ambientais, incluindo a sensação de alimentos ou a detecção de produtos químicos aversivos. Quando avaliados através deste protocolo, os organismos defeituosos atravessaram imediatamente a barreira, mas também foram incapazes de detectar uma fonte de alimento. Portanto, esses mutantes atravessam repetidamente a barreira química apesar de terem chegado temporariamente a uma fonte de alimento. Este ensaio pode facilmente testar populações de vermes para avaliar potenciais defeitos de via relacionados à aversão e à fome.

Introduction

Caenorhabditis elegans tem sido usado como modelo para o estudo da neurobiologia por décadas devido à relativa facilidade na análise dos circuitos de um sistema nervoso composto de apenas 302 neurônios 1 . Desde que o organismo dependa de responder a pistas ambientais, grande parte do sistema nervoso é dedicado a regular a integração de sinais ambientais 2 . Apesar da simplicidade de seu sistema nervoso, C. elegans pode detectar e responder a diversos sinais ambientais, incluindo repelentes 3 , atrativos 4 , temperatura 5 e até mesmo umidade 6 . A incapacidade de integrar adequadamente os sinais do ambiente tem sido associada a uma série de distúrbios comportamentais e doenças neurodegenerativas em sistemas modelo de mamíferos 7- 9. Com uma gama de modelos disponíveis de doença neural 10 em C. elegans e o desenvolvimento de telas farmacêuticas de nemátodos 11 , este organismo provou ser um sistema útil para o estudo da neurobiologia. Dada a disponibilidade de um conector de nemátodos cartografado 1 e mutações para quase todos os genes do genoma 12 do nematóide, nossa compreensão do sistema nervoso do nematóide e, por extensão, a nossa própria, é parcialmente limitada pelo desenho de ensaios criativos apropriados.

Uma série de ensaios de quimiotaxia foram desenvolvidos ao longo dos últimos 40 anos para avaliar a resposta de nematóides a diversos estímulos aversivos 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . A experimentação inicial envolveu a introdução de um estímulo ambiental agudo enquanto um único verme vagava em uma placa de ágar= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Mudanças imediatas nas respostas locomotrizas foram registradas. Por exemplo, o octanol injetável volátil pode ser aplicado a um cabelo e flutuou na frente do nariz de um nematóide para estimular o início da locomoção para trás em vermes selvagens 17 . Ensaios mais complexos também foram desenvolvidos para incorporar variáveis ​​múltiplas como meio de avaliar a escolha comportamental 18 . Uma variação deste ensaio implica o uso de uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva 4 . Um atrativo, a saber, diacetil, foi colocado em um lado da barreira química com os vermes transferidos para fora da fonte de diacetilo. Worms defeituoso para as respostas de aversão ao cobre imediatamente atravessou a barreira para atingir o diacetil, enquanto que as vermes do tipo selvagem foram inicialmente repelidas pela barreira. As respostas foram marcadas quando os vermes se aproximaram pela barreira de cobreSem observações de longo prazo.

Quando os vermes são avaliados depois de sofrerem condições de fome, sua sensibilidade aos estímulos ambientais diminui 19 . Quando o octanol químico aversivo é conduzido na frente do nariz dos nematóides, os organismos de tipo selvagem estimulam o movimento para trás dentro de 3 a 5 s quando em alimentos. Após estes organismos terem sido removidos dos alimentos durante 10 min, eles apresentam uma resposta tardia de 8-10 s 20 . Assim, com o aumento da fome, os nemátodos exibem uma resposta aversiva diminuída aos sinais ambientais prejudiciais, uma vez que a busca de alimentos se torna mais essencial para a sobrevivência. Por outro lado, os nemátodos que exageram o receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , não respondem ao octanol sobre ou fora dos alimentos e apresentam incapacidade de responder a uma série de estímulos aversivos 21 . Esses organismos npr-9 (GF) também não modulam sua freqüência de reversão na presença de alimentos, mas podemInverter em resposta a estímulos tácteis agressivos, indicando que eles são capazes de locomoção para trás 21 . Nós também avaliamos os mutantes npr-9 (LF), dado que eles exibem uma freqüência de reversão anormalmente diminuída dos alimentos, mas podem modular seu comportamento na presença de alimentos 21 . O acasalamento do estado nutricional do sem-fim com a introdução de estímulos externos agudos ajudou a elucidar os mecanismos pelos quais uma via relacionada ao alimento pode modular amplamente as vias de sinalização sensorial 22 , 23 . A presença de alimentos no ambiente de nemátodos também foi usada para avaliar respostas de retirada de etanol 24 . Neste experimento, os vermes foram incubados em diferentes concentrações de etanol e depois foram colocados em uma placa de ágar com um remendo de alimento conhecido como "ensaio de raça alimentar". O parto de comida foi colocado em uma borda da placa enquanto os nematóides wAntes da distância da fonte de comida. A retirada de etanol foi avaliada medindo a duração do tempo necessário para que os vermes alcancem o remendo de alimentos.

Este ensaio de aversão de cobre com base em nutrientes baseia-se no ensaio da raça alimentar para integrar variáveis ​​ambientais adicionais, nomeadamente alimentos e cobre, ao mesmo tempo que avaliam as mudanças comportamentais ao longo do tempo. Esta é uma adaptação de um protocolo de uso comum em toda a comunidade C. elegans 4 . Este protocolo tem sido utilizado para avaliar respostas aversivas e a detecção de alimentos ao longo de um período de quatro horas 21 . Uma vez que os comportamentos de fome de exibição de vermes após 30 minutos de privação de alimentos 25 , também podemos avaliar como as mudanças no estado nutricional podem influenciar as respostas ambientais. As condições deste ensaio medem como os organismos experimentais alteram a capacidade de resposta aos estímulos aversivos ao longo do tempo, portanto, avalia as mudanças comportamentais comoOs organismos progridem para um estado de fome (e continuam as medidas de fome prolongada). Uma vez que os animais npr-9 (GF) não alteram seu comportamento em resposta a alimentos ou muitas pistas aversivas, buscamos identificar se esses déficits comportamentais persistiriam no contexto da fome. Em última análise, este design de ensaio foi formulado para avaliar especificamente os mutantes npr-9 (GF), mas pode ser ainda adaptado para caracterizar novas variedades.

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Protocol

1. Preparação de organismos experimentais

  1. Escolha 10 nemátopos encenados L4 por estirpe 24 h antes de iniciar o ensaio para garantir que os organismos sejam adultos jovens quando testados. Para cada mutante ou nematóide de controle testado, escolha 10 L4s (10 para o controle e 10 para o ensaio).
    1. Manter os organismos L4 usando métodos padrão 26 , 27 durante 24 h em placas de ágar padrão semeadas com OP50 Escherichia coli . Se os organismos forem perdidos durante as etapas de lavagem subsequentes, compense aumentando o tamanho da amostra inicial ( ou seja, coloque 20 vermes em vez de 10).
      Nota: O comportamento é um fenótipo indevidamente variável. Execute o método em triplicado para cada tensão em três dias separados. Inclua tensões de controle adicionais e condições para novas tensões, como destacado na seção de discussão.
  2. Imediatamente antes do ensaio, transferir orga experimentalNismos para uma placa de ágar sem bactérias e permitir que os nematóides se movam livremente durante 1 minuto para remover o excesso de bactérias.
    1. Se os organismos experimentais tiveram condições de contaminação durante as 24 h anteriores ao ensaio, descarte-os.
  3. Pipetar 1 mL de M9 na placa sem bactéria para lavar vermes em um tubo de microcentrífuga.
  4. Centrifugar a 3.000 xg por 1 min. Worms deve formar uma pelota no fundo do tubo. Solução Aspirar M9 sem perturbar a pelota de sem-fim. Adicione 1 mL de M9 à pastilha de sem-fim, invertendo o tubo para misturar vermes com a solução.
  5. Repita as etapas 1.4 mais três vezes.
    1. Se o excesso de bactéria foi inicialmente transferido com os vermes, repita por um total de 5 vezes. Nenhuma bactéria deve ser transferida para as placas de alimentação de cobre. Se o alimento for transferido para a placa de ensaio, ele irá interferir com a coleta precisa de dados.
  6. Após a lavagem final, aspirar o sobrenadante até 10081; L de M9 e a pele de sem-fim permanecem.
    Atenção: os comportamentos relacionados com a fome tornam-se evidentes após 30 min. Conseqüentemente, os vermes devem ser transferidos imediatamente da solução, uma vez que os passos de lavagem foram concluídos.

2. Preparação de placas de ensaio

  1. Prepare placas de agar NGM padrão dois dias antes do ensaio.
    1. Se as placas forem mantidas em um ambiente úmido, faça placas de ágar 3 dias antes do ensaio. Alternativamente, retire a tampa da placa por 3-6 h para garantir a secura adequada (se em um ambiente estéril).
  2. Com um marcador permanente espesso, faça uma linha na parte inferior da placa ao longo da borda externa e outra para formar uma barreira de linha média ( Figura 1 ). A barreira da linha média deve ser equidistante de cada borda da placa. Use uma régua para garantir medições precisas. Essas linhas servirão de guia ao transferir bactérias e a solução de cobre. Providenciou queE. coli é transferida antes da solução de cobre, essas linhas servirão como indicadores.
  3. Placa de semente com 50 μL de OP50 E. coli em apenas um lado da barreira de cobre para criar um gramado uniforme ( Figura 2 ). A concentração bacteriana deve permanecer consistente em todos os ensaios; No entanto, pouca variabilidade foi observada em resposta a diferenças leves na concentração.
    1. Use as linhas marcadas na parte inferior da placa para garantir que as bactérias não entrem em contato com a solução de cobre. Desde que a solução de cobre alinhe a borda da placa e forme uma barreira de linha média, transfira a bactéria para que a solução de cobre não entre em contato com a fonte de alimento.
  4. Marque um segundo conjunto de placas e transfira-os não OP50 E. coli ( Figura 2 ). Essas placas servirão para avaliar o controle negativo. Essas placas também devem ter umMarcando em uma metade da placa para denotar a origem da transferência inicial.
  5. Permitir que as bactérias se sectem, depois incubar as placas a 37 ° C durante a noite. Certifique-se de que os remendos bacterianos não sejam perturbados ao se transferir para uma incubadora ou sala de 37 ° C. Perturbações excessivas podem alterar a localização ou a forma do remendo de alimentos.

3. Ensaio de quimiotaxis

  1. Prepare uma solução de sulfato de cobre (II) 0,5 M antes da hora de início do ensaio. Desde que sejam utilizados 125 μL da solução por placa, amplie este volume dependendo do número de placas de ensaio utilizadas ( por exemplo, 5 placas de ensaio, 625 μL).
  2. Pipetar 100 μL da solução de sulfato de cobre (II) na borda do ágar para criar uma barreira de cobre externa. O lado inferior marcado da placa deve servir de guia.
  3. Pipetar 25 μL da solução de sulfato de cobre (II) para criar uma barreira da linha média.
    1. Certifique-se de que a solução de sulfato de cobre (II)Não entra em contato com o remendo bacteriano. Use uma técnica manchada, uma vez que a varredura pode afetar a locomoção devido a entalhes / arranhões no ágar.
  4. Deixe a solução de cobre secar na placa. O período de tempo pode variar dependendo das condições de placa e laboratório. Verifique visualmente a secura a cada 5 minutos após a transferência.
    Nota: A solução de cobre apresenta uma tonalidade azulada e é facilmente identificável. Use um lenço de laboratório para tomar levemente a solução perto da borda da placa para discernir a secura.
  5. Pipetar 20 μL da pastilha de sem-fim do fundo do tubo na metade sem bactéria da placa de ensaio.
    1. Certifique-se de que 10 vermes são transferidos para a placa de ensaio. Se extras adicionais foram incluídos acidentalmente, remova-os escolhendo com óleo de halocarbono para garantir que nenhuma bactéria seja adicionada à placa. Cada ensaio deve ter um número consistente de nemátodos durante o ensaio.
      NOTA: se muito poucos vermes são transfErrado durante os ensaios, o aumento do tamanho da amostra inicial mitiga as perdas potenciais durante lavagens e transferências.
  6. Remova o excesso de M9 da placa com um tecido de laboratório. M9 não deve entrar em contato com a solução de sulfato de cobre (II).
    Cuidado: Certifique-se de que os vermes e a superfície do ágar permanecem inalterados ao executar esta etapa. Se usado com muita dureza, o tecido do laboratório pode criar entalhes na superfície de agar da placa e pode remover vermes. Worms acidentalmente removidos via KimWipe devem ser descartados.
  7. Uma vez que a solução M9 foi removida e todos os vermes começaram os padrões de locomotriz não líquida, comece o cronômetro do ensaio.
    1. Otimamente, remova a solução M9 dentro de um min. O parâmetro essencial é a identificação da locomoção sinusoidal. Worms locomote de forma diferente, por exemplo , batendo em vez de sinusoidal, quando em líquido. Comece o teste de parada de ensaio uma vez que cada um dos órgãos experimentaisIsms pára de bater.
  8. Verifique as placas de ensaio a cada 30 min.
    1. Para as placas de ensaio com manchas bacterianas, marcar positivamente os organismos se atingirem o parto alimentar ao longo de um período de 4 h. Para as placas de controle negativo, marcar positivamente os organismos se eles cruzaram a barreira.

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Representative Results

Utilizamos o tipo selvagem (N2), npr-9 (tm1652) e uma tensão de supressão npr-9 , ou seja , npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), para avaliar as respostas à fome e à aversão ao cobre. Os organismos de tipo selvagem são capazes de detectar e responder à barreira de cobre aversiva, enquanto os mutantes npr-9 (GF) não iniciam uma resposta aversiva ao cobre ao longo do ensaio de 4 h 21 . Após 30 min de inanição, cerca de 50 a 60% dos organismos de tipo selvagem (N2) atravessam a barreira de cobre e atingem o parto alimentar. Na marca de 2 h, 75% dos nematóides de tipo selvagem atingem a fonte de alimento. Ao final do ensaio, 100% dos organismos N2 foram transferidos para a fonte de alimento. Em contraste, a maioria dos organismos npr-9 (GF) não modulam os padrões de locomotriz em resposta aos alimentos e continuarão a atravessar a barreira aversiva mesmo depois de entrar em contato com um alimentofonte. Os vermes npr-9 (GF) continuamente não conseguem alterar sua locomoção em resposta ao alimento ao longo do ensaio de 4 h e apenas 30% dos organismos de teste são encontrados nos alimentos a qualquer momento. Os animais npr-9 (LF) não funcionam bem como os organismos N2, mas modulam seus padrões de locomotriz à medida que a fome aumenta para alcançar o parto alimentar ( Figura 3 ). Quando os organismos N2 ou npr-9 (LF) são avaliados através deste ensaio sem alimentos, eles raramente atravessam a barreira de cobre. Os mutantes npr-9 (GF) cruzam repetidamente a barreira para trás e para a frente ( Figura 4 ).

figura 1
Figura 1 : Uma representação visual das marcas para indicar a colocação da solução de cobre no lado de baixo de uma placa de Petri de 5 cm. Essas indicações são usadas para garantir queAs seções da placa foram adequadamente medidas e servem de guia ao transferir o remendo bacteriano e depois a solução de cobre sobre a superfície do ágar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2 : O prato de Petri de 5 cm é dividido em duas secções para as placas de ensaio de alimentos on-line e fora e um gramado bacteriano é formado no centro de uma dessas seções para a placa de comida. O parto alimentar não deve entrar em contato com o composto de teste que alinha as arestas da placa e forma uma barreira da linha média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<P class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figura 3
Figura 3 : Porcentagem de N2, npr-9 (tm1652) e npr-9 (GF) Worms que alcançam a fonte de alimentos durante um período de quatro horas em resposta ao ensaio de aversão ao cobre com base em estado nutricional. Os pontos de dados são médias de pelo menos três experimentos (n> 30 vermes) realizados em dias separados para ambas as cepas. Os dados são apresentados como média ± erro padrão e analisados ​​com ANOVA de medidas repetidas de duas vias. ** p <0,01, significativamente diferente dos animais N2 em condições idênticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 : Porcentagem de células N2, npr-9 (tm1652) e npr-9 (GF) que atravessam a barreira de cobre sem fonte alimentar ao longo de um ensaio de quatro horas. As cepas acima mencionadas foram avaliadas quanto à aversão ao cobre na ausência de alimentos. As respostas positivas são marcadas como cruzamento da barreira de cobre e permanecem na metade não-original da placa. Os pontos de dados são médias de pelo menos três experimentos (n> 30 vermes) realizados em dias separados para ambas as cepas. Os dados são apresentados como média ± SE e pelo menos 10 animais foram ensaiados em três experiências independentes analisadas com ANOVA de medidas repetidas de duas vias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este design de ensaio modifica o ensaio de ração alimentar 24 para incluir uma solução de cobre para criar uma barreira da linha média aversiva e ao redor da borda da placa para evitar a perda de nemátodos. Os organismos são testados quanto à sua capacidade de atravessar a barreira aversiva e alcançar um parto alimentar ao longo de um período de 4 h. No contexto de npr-9 (GF) , utilizamos este ensaio para avaliar como as condições de inanição podem afetar as respostas aversivas e a detecção de alimentos. Desde que anteriormente caracterizamos o npr-9 (GF) como defeituoso para a resposta aos alimentos e sugestões aversivas, combinamos múltiplas pistas ambientais com o estado nutricional para avaliar se a inanição poderia modular os comportamentos defeituosos npr-9 (GF) . Este ensaio baseia-se na habilidade de um vermeiro para detectar e responder a estímulos químicos e sugestões alimentares 3 , 4 . Dadas as diversas variáveis ​​analisadas, as condições do exOs organismos perimentais devem ser meticulosamente controlados para eliminar fatores de confusão. Para mutantes não caracterizados, ou seja , aqueles com aversão desconhecida ou capacidade de resposta alimentar, as cepas de controle adicionais deveriam ser utilizadas. Esforços aversos defeituosos, por exemplo , che-2 ou odr-3 28 , e os mutantes que não alteram os padrões de locomotriz dos alimentos, p . Ex. , Tph-1 29 , também devem ser avaliados em paralelo para garantir que as condições de cobre e fome sejam adequadamente controladas. Além disso, para destacar mais diretamente a contribuição da inanição para o comportamento avaliado, condições de ensaio separadas também podem ser desenvolvidas para controles adicionais. Por exemplo, os nematóides podem ficar famintos imediatamente antes do ensaio e transferidos para a placa de ensaio (com alimentos) para identificar a rapidez com que um organismo em estado de fome irá responder ao cobre e alcançar o parto de alimentos. Nosso ensaio atual destaca avRespostas inovadoras à medida que os organismos experimentais progridem de um estado bem alimentado para um estado de fome.

Nosso ensaio é uma modificação do ensaio de quimiotaxia de C. elegans, comumente usado em 4, no qual um estímulo mais forte ( ou seja, alta concentração) foi incorporado para avaliar os comportamentos durante um período de tempo mais longo. Em vez de avaliar respostas instantâneas, este ensaio pode ser utilizado para medir mudanças em respostas aversivas à medida que os organismos progridem para um estado de fome (se os controles necessários estiverem incluídos). Avaliações semelhantes foram utilizadas na ausência de cobre para avaliar respostas de retirada de etanol, ou seja , nematóides que localizam alimentos, ao longo do tempo 24 .

Como é o caso de qualquer ensaio comportamental em C. elegans, o controle de variáveis ​​ambientais é essencial para garantir resultados consistentemente reprodutíveis. Os organismos devem ser todos da mesma agE, dado que as respostas comportamentais podem variar com a idade. Além disso, a variabilidade no estado nutricional dos vermes pode alterar a aclimatação às condições de fome. Portanto, os vermes experimentais não devem sofrer fome em qualquer ponto antes desse protocolo. A experiência de fome da geração parental também pode influenciar o comportamento da progênie 30 ; Portanto, é aconselhável garantir que os organismos experimentais sejam bem alimentados por pelo menos duas gerações. Além disso, o número de organismos transferidos para as placas de ensaio deve permanecer consistente dado que a densidade populacional local pode influenciar as taxas de dispersão 31 . Uma vez que os vermes foram transferidos para as placas, é fundamental remover a solução de M9 em excesso com um tecido de laboratório sem danificar a superfície do ágar. A alteração na superfície pode interferir nos padrões de locomotriz espontânea. A solução excedente precisa ser removida apropriadamente antes de começar o início oficial deO ensaio para garantir que o comportamento de batida, ou seja , um padrão de locomotriz de nemátodos observado em líquido, não está presente. Um indicador claro é procurar o comportamento de rastreamento.

As placas de ensaio devem ser controladas de modo a que a placa e a secura bacteriana sejam consistentes. Placas excessivamente novas podem causar defeitos locomotricos e também podem interferir na detecção de estímulos ambientais 6 . A aplicação das soluções de cobre deve ser o mais consistente possível para que as barreiras aversivas sejam adequadamente espessas e não entrem em contato com a fonte de alimento. A aplicação de uma solução de cobre muito pequena poderia diminuir o tempo de resposta aversiva de tipo selvagem, enquanto demais poderiam ser letais para os nemátodos. O objetivo de uma espessura uniforme para a solução de cobre produz os melhores resultados. Se forem criadas indentações no agar durante a aplicação da solução de cobre, a placa de ensaio deve ser descartada. Worms pode atravessar esses buracos 32, Especialmente quando confrontados com uma substância aversiva ou fome. Para garantir a uniformidade da placa entre as amostras, populações misturadas de vermes ( ou seja, um tipo mutante e selvagem) poderiam ser medidas na mesma placa se uma delas estivesse claramente marcada ( por exemplo, via GFP).

Embora este ensaio tenha sido realizado em placas de ágar de tamanho padrão, placas maiores podem ser usadas ( por exemplo, 100 mm de diâmetro). Nesse cenário, a duração do ensaio deve ser estendida para 6 h para proporcionar tempo suficiente para o movimento do verme. Placas maiores poderiam permitir o teste de populações maiores e poderiam ser usadas para investigar como a densidade populacional afeta as respostas aversivas em longos períodos de tempo. Mais procedimentos tecnicamente avançados também podem ser incorporados com o uso de equipamentos de rastreamento de vermes acoplados a um estágio móvel 33 . O rastreamento de vermes permitiria medições mais precisas e permitiria a coleta de variáveis ​​adicionais ( por exemplo,

O ensaio pode ser facilmente adaptado para permitir a medição de fenótipos alternativos. A idade do verme pode ser variada para permitir medições em alterações aversivas induzidas por fome relacionadas com a idade. Além disso, as variações no estado nutricional dos vermes experimentais também podem permitir a análise da habituação à fome no contexto da aversão alimentar e química. Enquanto os protocolos forem consistentes entre conjuntos de dados comparáveis, quase qualquer pré-condicionamento de organismos experimentais poderia ser avaliado através do teste de quimiotaxia.

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Disclosures

Não temos nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant RGPIN36481-08 para William G. Bendena.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] Produced in lab
Cupric Sulfate Sigma C-1297 Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M

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References

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UMA<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensaio de Aversão ao Cobre Baseado em Status Nutricional
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Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D.,… More

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (125), e55939, doi:10.3791/55939 (2017).

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