في فيفو التصوير من "الفئران مراسل" Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل مع المجالات الطيفية الضوئية التماسك التصوير المقطعي وفحص تنظير العين الليزر
Summary
ويصف هذا البروتوكول عالية الدقة كيف تقنيات التصوير مثل التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي وفحص تنظير العين الليزر يمكن أن تستخدم في القوارض الصغيرة، باستخدام نظام منصة تصوير العيون، للحصول على معلومات حول ميكروجليال وسمك الشبكية خلية التوزيع، على التوالي.
Abstract
التصوير المقطعي بالتماسك الضوئية المجال الطيفي (SD–أكتوبر) والمسح الضوئي الليزر تنظير العين (سلوفاكيا) تستخدم على نطاق واسع في طب العيون التجريبية. في هذا البروتوكول، الأخضر الفئران معربا عن بروتين فلوري (بروتينات فلورية خضراء) تحت مروج Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل) واستخدمت صورة microglia الخلايا في الجسم الحي في الشبكية. Microglia الضامة المقيمين من الشبكية وقد تورط في عدة أمراض الشبكية1،2،3،4،،من56. يوفر هذا البروتوكول نهجاً مفصلة لجيل من الشبكية ب-عمليات المسح، مع التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر، وتصوير microglia خلية التوزيع في الفئران Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل مع سلوفاكيا في فيفو، باستخدام نظام منصة تصوير العيون. يمكن استخدام البروتوكول في العديد من خطوط الماوس مراسل. ومع ذلك، توجد بعض القيود على البروتوكول المعروضة هنا. أولاً، كل من سلوفاكيا والتنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر، عند استخدامها في وضع عالي الاستبانة، وجمع البيانات مع ارتفاع القرار المحوري ولكن القرار الأفقي أدنى (3.5 ميكرون و 6 ميكرومتر، على التوالي). وعلاوة على ذلك، مستوى التركيز والتشبع في سلوفاكيا تعتمد اعتماداً كبيرا على اختيار المعلمة والمحاذاة الصحيحة للعين. بالإضافة إلى ذلك، استخدام أجهزة مصممة للمرضى البشرية في الفئران صعبة بسبب قوة العين الماوس الضوئية مجموع أعلى مقارنة بالعين البشرية؛ هذا يمكن أن يؤدي إلى الوحشي التكبير المغالطات7، التي تعتمد أيضا على نسبة التكبير بالعدسة الماوس بين أمور أخرى. ومع ذلك، وبالرغم من هذا الموقف المسح المحوري مرهون بالتكبير الأفقي، القياسات SD–أكتوبر المحوري دقيقة8.
Introduction
في طب العيون التجريبية، يتم عادة تقييم الفحص الباثولوجي الشبكية باستخدام تقنيات نسيجية. ومع ذلك، علم الأنسجة يتطلب يوثانيزيشن الحيوانية وقد يسبب تغيير في الخصائص الفعلية للأنسجة. SD–أكتوبر وسلوفاكيا بشكل روتيني وتستخدم في طب العيون السريري لأغراض التشخيص والرصد لعدة أمراض الشبكية مثل السكري وذمة بقعيه9أو اعتلال الأعصاب البصرية الدماغية الأمامية10التهاب الشبكية الصباغي11 . SD–أكتوبر وسلوفاكيا هي تقنيات غير الغازية التي تولد صور عالية الاستبانة للشبكية، التي هي تصور عن طريق التلميذ المتوسعة دون أي تدخل آخر. SD–أكتوبر معلومات البنية الشبكية وسمك الشبكية عن طريق جمع البيانات باكسكاتيرينج لإنشاء الصور المقطعية الشبكية، بينما سلوفاكيا يجمع البيانات الأسفار لإنتاج صور عالية التباين مجسمة الشبكية. في الوقت الحاضر، تستخدم بشكل متزايد في طب العيون تجريبية باستخدام القوارض الصغيرة12،13،،من1415 (أو16،الزرد حتى17) كلا التقنيات ويمكن تقديم كل المعلومات النوعية والكمية12،17،،من1819،،من2021.
يمكن تصور تراكم fluorophores الذاتية مثل ليبوفوسسينس أو تشكيل دروسين في الشبكية بسلوفاكيا كإشارة السيارات الفلورسنت. هذه الميزة يجعل سلوفاكيا تقنية قيمة لتشخيص ورصد الأمراض الشبكية مثل البقعي المرتبطة بالسن أو التهاب الشبكية الصباغي22،23. في طب العيون التجريبية، يمكن استخدام صف السيارات التصوير (بالعربية) للكشف عن أنواع الخلايا المحددة في خطوط الماوس مراسل. على سبيل المثال، الفئران متخالف للتعبير عن التجارة والنقل تحت مروج Cx3cr124 مفيدة للتصور في فيفو خلايا microglial في الشبكية العادي والتحقيق في microglia/بلعم الديناميات في أمراض الشبكية21. Microglia هي الضامة المقيم الشبكية، التي تلعب دوراً حاسما في التوازن الأنسجة وإصلاح الأنسجة عند الإصابة1،،من2526. وأفيد في إصابة الشبكية، الاسكيمية، وانحطاط، يشير إلى دور هذه الخلايا في أمراض الشبكية2،3،،من45، Microglia التنشيط في شبكية العين 6.
ويهدف هذا البروتوكول وصف طريقة بسيطة نسبيا لتصوير الشبكية، وقياس سمك الشبكية باستخدام SD، تشرين الأول/أكتوبر، والتصور للتجارة والنقل microglia إيجابية الخلايا في Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل الماوس الشبكية باستخدام سلوفاكيا (نظام “سبيكتراليس هايدلبرغ” HRA + OCT). ويمكن استخدام هذا البروتوكول لقياسات التصوير وسمك شبكية العين سليمة أو مريضة في خطوط الماوس المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليل شكلي للتعرف على والتحديد الكمي لأرقام microglia و microglia التنشيط في الشبكية باستخدام سلوفاكيا21. Microglia الخلايا المرتبطة بالأمراض التنكسية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك الشبكية27،،من2829. وهكذا، من خلال الجمع بين الطريقتين المستخدمة في هذا البروتوكول، يمكن إجراء ارتباط توزيع microglia وتنكس الشبكية، التي يمكن أن تيسر رصد شدة المرض أو النهج فعالية علاجية في فيفو.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه المادة يوضح بروتوكول لاقتناء الشبكية ب-المسح والتصوير للتجارة والنقل التوزيع microglia الإيجابية في الشبكية الماوس في نفس جلسة التصوير. يتزايد استخدام SD، تشرين الأول/أكتوبر وسلوفاكيا في نماذج حيوانية من أمراض الشبكية لتوفير معلومات للتعديلات الشبكية عبر الوقت10،،</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل على منحة من “مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية” (سنسف؛ #320030_156019). المؤلفون بتأييد الاستدانة من GmBH الهندسية هايدلبرغ، ألمانيا.
Materials
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
Riferimenti
- Madeira, M. H., Boia, R., Santos, P. F., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Contribution of microglia-mediated neuroinflammation to retinal degenerative diseases. Mediators Inflamm. , 673090 (2015).
- Ng, T. F., Streilein, J. W. Light-induced migration of retinal microglia into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (13), 3301-3310 (2001).
- Langmann, T. Microglia activation in retinal degeneration. J Leukoc Biol. 81 (6), 1345-1351 (2007).
- Joly, S., et al. Cooperative phagocytes: resident microglia and bone marrow immigrants remove dead photoreceptors in retinal lesions. Am J Pathol. 174 (6), 2310-2323 (2009).
- Arroba, A. I., Alvarez-Lindo, N., van Rooijen, N., de la Rosa, E. J. Microglia-mediated IGF-I neuroprotection in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 9124-9130 (2011).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Exp Eye Res. 81 (6), 700-709 (2005).
- Geng, Y., et al. Optical properties of the mouse eye. Biomed Opt Express. 2 (4), 717-738 (2011).
- Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in SD-OCT imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
- Vaz-Pereira, S., et al. Optical Coherence Tomography Features Of Active And Inactive Retinal Neovascularization In Proliferative Diabetic Retinopathy. Retina. 36 (6), 1132-1142 (2016).
- Kokona, D., Haner, N. U., Ebneter, A., Zinkernagel, M. S. Imaging of macrophage dynamics with optical coherence tomography in anterior ischemic optic neuropathy. Exp Eye Res. , (2016).
- Makiyama, Y., et al. Macular cone abnormalities in retinitis pigmentosa with preserved central vision using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. PLoS One. 8 (11), e79447 (2013).
- Paques, M., et al. High resolution fundus imaging by confocal scanning laser ophthalmoscopy in the mouse. Vision Res. 46 (8-9), 1336-1345 (2006).
- Joshi, R., et al. Spontaneously occurring fundus findings observed using confocal scanning laser ophthalmoscopy in wild type Sprague Dawley rats. Regul Toxicol Pharmacol. 77, 160-166 (2016).
- Muraoka, Y., et al. Real-time imaging of rabbit retina with retinal degeneration by using spectral-domain optical coherence tomography. PLoS One. 7 (4), e36135 (2012).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Huber, G., et al. Spectral domain optical coherence tomography in mouse models of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (12), 5888-5895 (2009).
- Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative Analysis of Mouse Retinal Layers Using Automated Segmentation of Spectral Domain Optical Coherence Tomography Images. Transl Vis Sci Technol. 4 (4), 9 (2015).
- Sim, D. A., et al. A simple method for in vivo labelling of infiltrating leukocytes in the mouse retina using indocyanine green dye. Dis Model Mech. 8 (11), 1479-1487 (2015).
- Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In vivo dynamics of retinal microglial activation during neurodegeneration: confocal ophthalmoscopic imaging and cell morphometry in mouse glaucoma. J Vis Exp. (99), e52731 (2015).
- Acton, J. H., Cubbidge, R. P., King, H., Galsworthy, P., Gibson, J. M. Drusen detection in retro-mode imaging by a scanning laser ophthalmoscope. Acta Ophthalmol. 89 (5), e404-e411 (2011).
- Greenstein, V. C., et al. Structural and functional changes associated with normal and abnormal fundus autofluorescence in patients with retinitis pigmentosa. Retina. 32 (2), 349-357 (2012).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Wang, X., et al. Requirement for Microglia for the Maintenance of Synaptic Function and Integrity in the Mature Retina. J Neurosci. 36 (9), 2827-2842 (2016).
- Ebneter, A., Casson, R. J., Wood, J. P., Chidlow, G. Microglial activation in the visual pathway in experimental glaucoma: spatiotemporal characterization and correlation with axonal injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6448-6460 (2010).
- Ebneter, A., Kokona, D., Schneider, N., Zinkernagel, M. S. Microglia Activation and Recruitment of Circulating Macrophages During Ischemic Experimental Branch Retinal Vein Occlusion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 944-953 (2017).
- Lin, Y. L., Potter-Baker, K. A. Using theoretical models from adult stroke recovery to improve use of non-invasive brain stimulation for children with congenital hemiparesis. J Neurophysiol. , (2017).
- Combadiere, C., et al. CX3CR1-dependent subretinal microglia cell accumulation is associated with cardinal features of age-related macular degeneration. J Clin Invest. 117 (10), 2920-2928 (2007).
- Bermudez, M. A., et al. Time course of cold cataract development in anesthetized mice. Curr Eye Res. 36 (3), 278-284 (2011).
- Toth, C. A., et al. A comparison of retinal morphology viewed by optical coherence tomography and by light microscopy. Arch Ophthalmol. 115 (11), 1425-1428 (1997).
- Ebneter, A., Kokona, D., Jovanovic, J., Zinkernagel, M. S. Dramatic Effect of Oral CSF-1R Kinase Inhibitor on Retinal Microglia Revealed by In Vivo Scanning Laser Ophthalmoscopy. Transl Vis Sci Technol. 6 (2), 10 (2017).
- Gabriele, M. L., et al. Reproducibility of spectral-domain optical coherence tomography total retinal thickness measurements in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (12), 6519-6523 (2010).
- Nakao, S., et al. Wide-field laser ophthalmoscopy for mice: a novel evaluation system for retinal/choroidal angiogenesis in mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (8), 5288-5293 (2013).
- Wang, N. K., et al. Origin of fundus hyperautofluorescent spots and their role in retinal degeneration in a mouse model of Goldmann-Favre syndrome. Dis Model Mech. 6 (5), 1113-1122 (2013).
- Wang, N. K., et al. Cellular origin of fundus autofluorescence in patients and mice with a defective NR2E3 gene. Br J Ophthalmol. 93 (9), 1234-1240 (2009).
- Thanos, S. Sick photoreceptors attract activated microglia from the ganglion cell layer: a model to study the inflammatory cascades in rats with inherited retinal dystrophy. Brain Res. 588 (1), 21-28 (1992).
- Hughes, E. H., et al. Generation of activated sialoadhesin-positive microglia during retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (5), 2229-2234 (2003).
