Этот протокол описывает как с высоким разрешением изображений методы, такие как спектральной области оптическая когерентная томография и сканирование лазерная офтальмоскопия могут быть использованы в мелких грызунов, с помощью офтальмологических изображений платформы системы, для получения информации о Толщина сетчатки и Микроглии клеток распределения, соответственно.
Спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Октябрь) и сканирующий лазер офтальмоскопия (SLO) широко используются в экспериментальной офтальмологии. В настоящем Протоколе, мышей выражая Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) под промоутер Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) были использованы для изображения Микроглии клеток в естественных условиях в сетчатке. Микроглии являются резидентов макрофаги сетчатки и были вовлечены в ряд заболеваний сетчатки1,2,3,4,5,6. Этот протокол обеспечивает детальный подход для поколения сетчатки Б-сканов, с SD-Октябрь и визуализация распределения Микроглии клеток в Cx3cr1gfp/gfp мышей с SLO в естественных условиях, с использованием офтальмологических тепловизионные системы платформы. Протокол может использоваться в нескольких линиях мыши репортер. Однако есть некоторые ограничения для протокола, представленные здесь. Во-первых, SLO и SD-Октябрь, когда используется в режиме с высоким разрешением, сбор данных с высоким разрешением осевой но латеральное разрешение ниже (3,5 мкм и 6 мкм, соответственно). Кроме того уровень внимания и насыщенность в SLO сильно зависит подбор параметров и правильное выравнивание глаза. Кроме того с помощью устройств, предназначенных для человека пациентов в мышей является сложной задачей из-за выше Общая оптическая сила мыши глаза по сравнению с человеческим глазом; Это может привести к боковым увеличение неточности7, который также зависит от масштаба линзы мыши среди других. Однако несмотря на то что положение осевой сканирования зависит от боковых увеличение, осевые измерения SD-Октябрь точной8.
В экспериментальной офтальмологии изучения патологии сетчатки обычно оценивается с использованием гистологических методов. Однако требует животных euthanization и может вызвать изменения в фактической свойства ткани гистологии. SD-OCT и SLO обычно используются в клинической офтальмологии для целей диагностики и мониторинга нескольких заболеваний сетчатки, например диабетического макулярного отека9, передней ишемической оптической невропатии10или пигментный ретинит11 . SD-OCT и SLO являются неинвазивные методы, которые создают изображения с высоким разрешением сетчатки, которые визуализируются через расширенные ученик без дальнейшего вмешательства. SD-OCT предоставляет информацию сетчатки структуры и толщина сетчатки, собирая обратного рассеяния данных для создания поперечных изображения сетчатки, в то время как SLO собирает данные флуоресценции для получения стереоскопических изображений высокой контрастностью сетчатки. В настоящее время обе методики все чаще используются в экспериментальной офтальмологии с помощью мелких грызунов12,13,14,15 (или даже данио рерио16,17) и может предоставить оба качественной и количественной информации12,,1718,19,,2021.
Накопление эндогенного флуорофоров как lipofuscins или формирования друз в сетчатке могут быть визуализированы в SLO как auto флуоресцентного сигнала. Эта особенность делает SLO полезен для диагностики и мониторинга заболеваний сетчатки, таких как age-related macular вырождения или пигментный ретинит22,23. В экспериментальной офтальмологии auto флуоресценции изображений (AF) может использоваться для обнаружения типов конкретных клеток в линиях мыши репортер. Например выгодные для визуализации в vivo Микроглии клеток в Нормальная сетчатка и для расследования микроглии/макрофагов мышей гетерозиготных для выражения гена gfp под промоутер Cx3cr124 динамика в сетчатки заболевания21. Микроглии являются резидентов макрофаги сетчатки, которые играют решающую роль на ткани гомеостаза и восстановление тканей после травмы1,25,26. Микроглии активации в сетчатке было сообщено в сетчатки травмы и ишемии, вырождение, предлагая роль этих клеток сетчатки заболевания2,3,4,5, 6.
Целью настоящего Протокола является описание относительно простой метод для сетчатки изображений и измерение толщины сетчатки, используя SD-Октябрь и для визуализации gfp позитивные Микроглии клеток в сетчатке мыши Cx3cr1gfp/gfp с помощью SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT системы). Этот протокол может использоваться для визуализации и толщина измерений здоровыми или больными сетчатки в различных линиях мыши. Кроме того морфометрический анализ может выполняться для идентификации и количественной оценки микроглии чисел и микроглии активации в сетчатке, используя SLO21. Микроглии клеток, связанные с дегенеративными заболеваниями центральной нервной системы (ЦНС), в том числе Сетчатка27,,2829. Таким образом комбинируя два методы, используемые в настоящем Протоколе, корреляция микроглии распределения и дегенерации сетчатки могут быть сделаны, которые могут облегчить мониторинг тяжести заболевания или эффективность терапевтических подходов в естественных условиях.
Настоящей статьи демонстрирует протокол для приобретения сетчатки Б-сканов и изображений gfp позитивные микроглии распределения в сетчатке мыши в том же сеансе изображений. SD-OCT и SLO все шире используются в животных моделях заболеваний сетчатки для предоставления информации сетчатки и?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом Швейцарский Национальный научный фонд (SNSF; #320030_156019). Авторы получили нефинансовой поддержки от Heidelberg Engineering GmBH, Германия.
Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
+4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
silicon forceps | N/A | N/A | |
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |