Высоко мультиплексированная, высокоразрешающая визуализация т-клеток с использованием madSTORM
Summary
Мы демонстрируем способ изображения нескольких молекул в гетерогенных наноструктурах с точностью одной молекулы с использованием последовательного связывания и элюирования флуоресцентно меченных антител.
Abstract
Для изображений гетерогенных клеточных структур, использующих одномодовую локализационную микроскопию, препятствовала неадекватная точность локализации и мультиплексирование. Используя флуоресцентные нано-алмазные фидуциальные маркеры, мы описываем процедуры коррекции и выравнивания дрейфа, необходимые для получения высокой точности в одномодовой локализации микроскопии. Кроме того, описана новая стратегия мультиплексирования madSTORM, в которой несколько молекул нацелены в одной и той же клетке с использованием последовательного связывания и элюирования флуоресцентных антител. MadSTORM демонстрируется на активированной Т-клетке, чтобы визуализировать расположение различных компонентов в связанной с мембраной структуре с несколькими белками, называемой микрокластером рецепторов Т-клеток. Кроме того, обсуждается применение madSTORM в качестве общего инструмента для визуализации многобелковых структур.
Introduction
Для преодоления дифракционного предела световой микроскопии (~ 200 нм) были разработаны различные методы микроскопии с высоким разрешением. Среди них – категория методов, называемых одномолекулярной локализационной микроскопией (SMLM), которая включает в себя фотоактивационную локализационную микроскопию (PALM) и стохастическую оптическую реконструктивную микроскопию (STORM). Методы SMLM участвуют в использовании флуорофоров, которые могут переключаться между (флуоресцентными) и выключенными (темными / фотопереключаемыми) состояниями, обеспечивая последовательную локализацию флуоресценции от одиночных молекул 1 , 2 , 3 .
Благодаря совместимости с коммерчески доступными красителями и микроскопами, прямой STORM (dSTORM) стал широко распространенным методом SMLM 4 . DSTORM может регулярно достигать точности локализации ~ 10 нм, определяемой как неопределенность при вычислении центра дифрагированияИонно-ограниченная функция точечного распространения (PSF). Однако, несмотря на высокую точность, оцененную с использованием алгоритмов локализации 5 , 6 , 7 , точное определение фактического расположения отдельных молекул затруднено рядом проблем. Во-первых, механическое перемещение ступени микроскопа во время получения изображения добавляет существенную неопределенность в точность локализации. Поскольку изображения SMLM получены в течение тысяч временных рамок, наномасштабные перемещения ступени микроскопа могут значительно скомпрометировать точность окончательного изображения с высоким разрешением 8 . Чтобы компенсировать перемещение сцены во время захвата изображения, сценический дрейф обычно оценивается на основе регрессионного подгонки локализованных локализаций из самого изображения (кросс-корреляция) или последовательных локализаций из фидуциальных маркеров (коррекция фидуциарных коррекций) 1 , 9 . HowevEr, эти методы требуют оптимизации нескольких параметров для каждого стека изображений и не могут учитывать перемещение ступеней на коротких временных масштабах, таких как механическая вибрация. Золотые наночастицы и многоцветные флуоресцентные гранулы использовались в качестве фидуциальных маркеров в SMLM, но они не являются фотостабильными и приводят к значительно меньшей точности после коррекции дрейфа, чем используемые флуоресцентные наноалмазы (FND) на основе азота В madSTORM 10 .
В дополнение к пределу дифракции световая микроскопия дополнительно ограничена спектральными пределами. Для одновременной визуализации нескольких целей требуются флуоресцентные зонды с неперекрывающимися спектральными профилями, обычно ограничивающие флуоресцентную световую микроскопию до 6 цветов и SMLM до 2-3 цветов 4 , 11 , 12 . Более того, нелинейная хроматическая аберрация вызывает несоосность многоцветных изображений, wДля чего требуются обширные процедуры выравнивания с использованием разноцветных фидуциальных маркеров 8 , 13 . Чтобы преодолеть эти ограничения, в предыдущих исследованиях были отображены множественные мишени с использованием повторного фотообесцвечивания или химического тушения последовательно связанных флуорофоров 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Хотя эти способы могут преодолевать спектральные пределы микроскопии, флуоресцентное отбеливание, как известно, является токсичным процессом 20 , а длительное отбеливание или тушение может вызвать нежелательные побочные эффекты, такие как потеря сшивки. Более того, накопление флуоресцентных зондов может привести к стерической блокировке сайтов связывания в образце, предотвращению крупномасштабного мультиплексирования и надежного нацеливания эпитопов. Чтобы избежать таких стерических помех,Tudy достигло мультиплексирования с использованием стохастического обмена свободно диффундирующих фрагментов белка 21 . В то время как этот метод позволяет плотную маркировку клеточных структур, он требует обширной биохимической подготовки для выделения пептидных фрагментов, не может локализовать положения одной молекулы и не может легко облегчить крупномасштабное мультиплексирование с использованием коммерчески доступных зондов. Мы представляем подробный видео-протокол, описывающий последовательное связывание и элюирование флуоресцентных антител для мультиплексированных изображений с ограниченным размером антител размером dSTORM (madSTORM), а также использование флуоресцентных нано-алмазов для достижения точной коррекции и выравнивания дрейфа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процедуры последовательного мультиплексирования, коррекции дрейфа и выравнивания в madSTORM обеспечивают точную, очень мультиплексированную визуализацию гетерогенных структур в клетках. 10 Кроме того, madSTORM избегает ограничений многоцветного STORM, таких как хроматическая абе…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Xufeng Wu за доступ к микроскопу STORM. Это исследование было поддержано Программой внутриутробных исследований Национального онкологического института (NCI) по исследованию рака и Национальным институтом сердца и легких крови (NHLBI).
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
