Mycket multiplexerad, superupplösning av T-celler med hjälp av madSTORM
Summary
Vi demonstrerar en metod för att bilda flera molekyler inom heterogena nanostrukturer vid enkel molekyls noggrannhet med användning av sekventiell bindning och eluering av fluorescensmärkta antikroppar.
Abstract
Imaging heterogena cellulära strukturer med användning av molekyl-lokaliseringsmikroskopi har hindrats av otillräcklig lokaliserings precision och multiplexeringsförmåga. Med hjälp av fluorescerande nano-diamantfiducialmarkörer beskriver vi driftkorrigerings- och anpassningsförfarandena som erfordras för att erhålla hög precision i enkelmolekyl lokaliseringsmikroskopi. Dessutom beskrivs en ny multiplexstrategi, madSTORM, i vilken multipla molekyler är riktade i samma cell med användning av sekventiell bindning och eluering av fluorescerande antikroppar. MadSTORM demonstreras på en aktiverad T-cell för att visualisera läget för olika komponenter i en membranbunden, multi-proteinstruktur kallad T-cellreceptormikroklusten. Dessutom diskuteras applicering av madSTORM som ett allmänt verktyg för visualisering av multi-proteinstrukturer.
Introduction
En mängd mikrosupplösningsmikroskopitekniker har utvecklats för att övervinna diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi (~ 200 nm). Bland dessa är en kategori av tekniker som kallas single molecule localization microscopy (SMLM) som inkluderar fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) och stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM). SMLM-tekniker delar i användningen av fluoroforer som kan växlas mellan på (fluorescerande) och av (mörka / fotoomkopplade) tillstånd, vilket möjliggör sekventiell lokalisering av fluorescens från enskilda molekyler 1 , 2 , 3 .
På grund av dess kompatibilitet med kommersiellt tillgängliga färgämnen och mikroskop har direkt STORM (dSTORM) blivit en allmänt vedertagen SMLM-teknik 4 . DSTORM kan rutinmässigt uppnå ~ 10 nm lokaliserings precision, definierad som osäkerheten vid beräkning av centrum för en diffraktionJon-begränsad punktspridningsfunktion (PSF). Trots den höga precisionen som uppskattats med användning av lokaliseringsalgoritmerna 5 , 6 , 7 har emellertid en bestämd bestämning av den faktiska placeringen av enskilda molekyler hindrats av ett antal problem. För det första lägger mekanisk rörelse av mikroskopsteget under bildförvärv stor osäkerhet på lokaliserings precision. När SMLM-bilder erhålls över tusentals tidsramar kan nanoskala-rörelser i mikroskopsteget på ett väsentligt sätt kompromissa med precisionen hos den slutliga superupplösningsbilden 8 . För att kompensera för scenrörelse under bildförvärv beräknas stegdrift vanligtvis från regressionsbaserad montering av inåtpositioneringar från själva bilden (korskorrelation) eller sekventiella lokaliseringar från fiducialmarkörer (fiducial-korrektion) 1 , 9 . howevDet innebär att dessa metoder kräver optimering av flera parametrar för varje bildstapel och kan inte redovisa scenrörelser vid korta tidsskalor som mekanisk vibration. Guldnanopartiklar och flerfärgade fluorescerande pärlor har använts som fiducialmarkörer i SMLM, men de är inte fotostabila och resulterar i signifikant lägre precision efter driftskorrigering än de fluorescerande nanodiamanterna (FND) som används för kvävgascentraler. I madSTORM 10 .
Förutom diffraktionsgränsen är ljusmikroskopi ytterligare begränsad av spektralgränser. Samtidig visualisering av flera mål kräver fluorescerande sonder med icke-överlappande spektralprofiler, vilket i allmänhet begränsar fluorescensbaserad ljusmikroskopi till 6 färger och SMLM till 2-3 färger 4 , 11 , 12 . Dessutom orsakar icke-linjär kromatisk avvikelse felinriktning av mångfärgade bilder, wSom kräver omfattande anpassningsförfaranden med hjälp av flerfärgade fiducialmarkörer 8 , 13 . För att övervinna dessa gränser har tidigare studier avbildat flera mål med användning av repetitiv fotobildning eller kemisk släckning av sekventiellt bundna fluoroforer 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Medan dessa metoder kan övervinna de spektrala gränserna för mikroskopi, är fluorescensblekning känt för att vara en toxisk process 20 , och långvarig blekning eller släckning kan orsaka oönskade bieffekter såsom förlust av tvärbindning. Vidare kan ackumuleringen av fluorescerande prober leda till sterisk blockering av bindningsställen i provet, förhindrande av storskalig multiplexering och robust målning av epitoper. För att undvika sådan sterisk störning, en nyligen sTudy uppnådd multiplexering med användning av stokastisk utbyte av fritt diffunderande proteinfragment 21 . Medan denna metod tillåter tät märkning av cellulära strukturer krävs det omfattande biokemisk beredning för att isolera peptidfragment, kan inte lokalisera molekylpositioner och lättar inte lätt för storskalig multiplexering med användning av kommersiellt tillgängliga prober. Vi presenterar ett detaljerat videoprotokoll som beskriver sekventiell bindning och eluering av fluorescensantikroppar för multiplexerad, antikroppstorleksbegränsad dSTORM (madSTORM) avbildning och användning av fluorescerande nanodiamanter för att uppnå exakt driftskorrigering och anpassning.
Protocol
Representative Results
Discussion
De sekventiella multiplexerings-, driftkorrigerings- och anpassningsförfarandena i madSTORM möjliggör exakt, högmultiplexerad visualisering av heterogena strukturer i celler. 10 Dessutom undviker madSTORM gränserna för multi-color STORM, såsom kromatisk aberration och suboptimal photowitching / emissionsegenskaper för icke-farfärgade färgämnen 9 , 12 . Eftersom elueringssteget signifikant minskar sterisk interferens från sekve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Xufeng Wu för åtkomst till STORM-mikroskopet. Denna forskning stöddes av Intramural Research Programmet från National Cancer Institute (NCI) Center for Cancer Research och National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
