تقنيات الفحص المجهري [كنفوكل] لدراسة تفاعلات البروتين البروتين وحركية في الحمض النووي آفات متقدمة
Summary
ميكرويرادييشن الليزر أداة مفيدة لإجراء دراسات لإصلاح الحمض النووي في الخلايا الحية. يتم عرض نهج منهجي لاستخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية للحث على مختلف الآفات الحمض النووي. ونحن قد الأمثل طريقة ميكرويرادييشن المحلية أن يحافظ على دورة الخلية الطبيعية؛ وهكذا، خلايا المشع المضي قدما من خلال الانقسام.
Abstract
ميكرويرادييشن المحلية مع الليزر يمثل أداة مفيدة للدراسات المتعلقة بالعمليات المتصلة بإصلاح الحمض النووي في الخلايا الحية. وهنا يصف لنا منهجية لتحليل حركية البروتين في الآفات الحمض النووي عبر الوقت أو البروتين-بروتين تفاعلات على الكروماتين ميكرويرادياتيد محلياً. ونحن أيضا إظهار كيفية التعرف على كل مراحل دورة الخلية استخدام نظام الهاتف الخلوي فوكسي لدراسة حركية الخلية-دورة-تعتمد على البروتين في الآفات الحمض النووي. وصف منهجية لاستخدام أشعة الليزر فوق البنفسجية اثنين (355 نانومتر و 405 نانومتر) للحث على أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي ويرد أيضا. انتقل من خلال الانقسام عادة فقط ميكرويرادياتيد الخلايا بليزر صمام ثنائي 405 نانومتر وكانت تخلو من سيكلوبوتاني بيريميدين dimers (وثائق). نعرض أيضا كيف يمكن أن تكون ثابتة الخلايا ميكرويرادياتيد في نقطة زمنية معينة لأداء إيمونوديتيكتيون البروتينات الذاتية للفائدة. دراسات إصلاح الحمض النووي، بالإضافة إلى ذلك يمكننا وصف استخدام الأساليب الفيزيائية الحيوية بما في ذلك فراب (Fluorescence الانتعاش بعد فوتوبليتشينج) وفليم (Fluorescence عمر التصوير المجهري) في الخلايا بصورة عفوية تحدث بؤر تلف الحمض النووي. نعرض أيضا طلبا من فليم-الحنق (Fluorescence الرنين الطاقة نقل) في الدراسات التجريبية لتفاعلات البروتين البروتين.
Introduction
أضرار الحمض النووي يؤدي إلى ظهور آفات الحمض النووي يتألف من سيكلوبوتاني بيريميدين dimers (وثائق البرامج القطرية)، 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine، وحبلا واحد أو مزدوج-حبلا فواصل1،2. أشعة γ هي الشكل الإشعاع المؤين بالطاقة أعلى و penetrance عالية، وبالتالي مصدر هذا الإشعاع يستخدم على نطاق واسع في العلاج الإشعاعي3. من ناحية أخرى، التي يسببها تجريبيا الحمض النووي الأضرار الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية أشعة الليزر يقلد التعرض الطبيعي لضوء الأشعة فوق البنفسجية. ميكرويرادييشن فوق البنفسجية، كطريقة مجهرية، يمثل أداة تجريبية لدراسة أضرار الحمض النووي في الخلايا الحية الفردية. واستخدمت ميكرويرادييشن لأول مرة منذ 40 عاماً من أجل الكشف عن تنظيم المناطق كروموسوم4،5. هذا الأسلوب يعتمد اعتماداً كبيرا على أما الخصائص الوظيفية لمجاهر [كنفوكل] أو حدود التقنية الحديثة نانوسكوبي. للحث على آفات الحمض النووي، يمكن بريسينسيتيزيد الخلايا 5 ‘ بروموديوكسيوريديني (بردو) أو هويشت 33342 قبل إشعاع الأشعة فوق البنفسجية. Bártová et al. 6 الموصوفة سابقا في الخطوة بريسينسيتيزيشن، ومؤخرا أننا الأمثل هذا الأسلوب ميكرويرادييشن لتفادي موت الخلية، أو المبرمج. على سبيل المثال، استخدام الليزر الأشعة فوق البنفسجية 405 نانومتر (دون هويشت 33342 بريسينسيتيزيشن) يؤدي إلى تنصيب 53BP1 إيجابية مزدوجة-حبلا فواصل (دسبس) على حساب سيكلوبوتاني بيريميدين dimers (وثائق البرامج القطرية). من ناحية أخرى، خطوات بريسينسيتيزيشن جنبا إلى جنب مع ميكرويرادييشن الأشعة فوق البنفسجية تحفز مستويات عالية جداً من مشاريع وثائق البرامج القطرية ودسبس في نفس الوقت7،8. هذه المنهجية من الصعب تطبيقه لدراسة مسار إصلاح الحمض النووي واحد.
مع ميكرويرادييشن، من الممكن تحليل البروتين التوظيف، والحركية، والتفاعل في الآفات الحمض النووي في الخلايا الحية. مثال على هذا الأسلوب ونشرت لويجستيربورج et al. 9 heterochromatin البروتين 1β، ونحن مؤخرا أظهرت للمرة الأولى أن توظيف عامل بلوريبوتينسي Oct4 وبروتين المرتبطة بالهيئات كاجال، كويلين،6،الآفات المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية الحمض النووي10. حركية البروتين في هذه الآفات الحمض النووي يمكن أن تدرس أيضا استخدام ال12،11،فراب (Fluorescence الانتعاش بعد فوتوبليتشينج)13 أو تآكل (Fluorescence الرنين الطاقة نقل) تقنيات14 ،15. هذه الأساليب قد يحتمل أن تكشف عن نشر بسيطة من البروتينات في الآفات الحمض النووي أو تفاعلات البروتين البروتين. هو أداة مفيدة لتحديد خصائص إضافية من البروتينات فليم (Fluorescence عمر التصوير المجهري) أو في التركيبة مع الحنق التكنولوجيا (الحنق-فليم)16. تمكن هذه الطرق دراسة العمليات في تعيش الخلايا التي يتم ثابت أو عابر التعبير عن البروتين التي تهم معلم ب جزيء فلوري17. وهنا يظهر مثال وقت تحلل أسي (τ) للبروتين p53 معلم بروتينات فلورية خضراء وشريكتها التفاعل، 53BP1 معلم مشري، لعب دوراً هاما في الحمض النووي الضرر استجابة18،19 . Τ المعلمة، عمر فلوروتشرومي المقدمة من حسابات فليم، محددة لصبغة fluorescence معينة ولها قدرات الربط وبيئتها الخلوية. ولذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تبين لنا الفروق بين الفئات السكانية الفرعية البروتين وقدراتهم ملزمة وخصائصها الفنية بعد، على سبيل المثال، الحمض النووي الضرر.
هنا، مخططا للأساليب المنهجية لتقنيات متقدمة في الفحص المجهري الذي يستخدم في المختبر لدراسة التوظيف البروتين محددة زمنياً وحركية، ونشر، وتفاعلات البروتين البروتين في الموقع الكروماتين ميكرويرادياتيد ويرد. وترد المنهجية خطوة بخطوة لاستحثاث المحلية آفات الحمض النووي في الخلايا الحية، ووصفاً لمنهجيات مفيدة لإجراء دراسات للأحداث المتعلقة بالحمض النووي-الضرر في المستحثة محلياً آفات الحمض النووي الناجم عن أشعة الليزر الأشعة فوق البنفسجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنيات الفحص المجهري تمثل الأدوات الأساسية في مختبرات البحوث. هنا، وصفاً موجزاً للأساليب المستخدمة لدراسة البروتين التوظيف وحركية في الآفات الحمض النووي. لاحظنا خصوصا لدينا الخبرة التجريبية في ميدان ميكرويرادييشن المحلية من الخلايا الحية، ونحن نناقش دراسة حركية البروتين بالتفاعل فراب…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل الوكالة المسؤولة عن المنح من الجمهورية التشيكية، ومشروع P302-12-G157. التجارب كانت مدعومة أيضا CZ09 برنامج البحوث النرويجية التشيكية، الذي يشرف على الصناديق النرويجية، ووزارة التربية والتعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية (منح رقم: 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
Riferimenti
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
