מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות
Summary
Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.
Abstract
Microirradiation המקומי עם לייזרים מייצג כלי שימושי עבור מחקרים של ה-DNA תיקון-תהליכים הקשורים בתאים חיים. כאן, אנו מתארים בגישה מתודולוגיים ניתוח קינטיקה חלבון ב- DNA נגעים על אינטראקציות חלבון-חלבון או על מקומי microirradiated כרומטין. אנו גם מראים כיצד לזהות שלבים נפרדים של מחזור התא באמצעות מערכת סלולרית Fucci ללמוד קינטיקה תא מחזור-תלוית חלבון ב- DNA נגעים. תיאור מתודולוגי של השימוש של שני UV לייזרים (355 nm ו 405 ננומטר) לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א גם מוצג. רק התאים microirradiated על ידי 405 ננומטר דיודת לייזר המשיך דרך מיטוזה בדרך כלל, היו ללא הדימרים פירימידין cyclobutane (CPDs). אנו גם מראים כיצד ניתן לתקן תאים microirradiated בנקודת זמן נתון כדי לבצע immunodetection של החלבונים אנדוגני של עניין. ללימודים תיקון ה-DNA, נתאר בנוסף השימוש בשיטות biophysical כולל FRAP (קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר Photobleaching) ו- FLIM (קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ) תאים עם המתרחשים באופן ספונטני DNA נזק מוקדים. אנו גם מראים יישום של FLIM-קשת/קשתית (קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה) במחקרים ניסיוני של אינטראקציות חלבון-חלבון.
Introduction
נזק לדנ א מוביל המראה של ה-DNA נגעים המורכב cyclobutane הדימרים פירימידין (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine, יחיד-strand או כפול-strand שובר1,2. Γ-קרני בצורת קרינה מייננת עם האנרגיה הגבוהה ביותר, penetrance גבוהה, וכך זה מקור קרינה נעשה שימוש נרחב הקרנות3. מצד שני, המושרה בניסוי נזקי DNA UV לייזרים מחקה טבעי בחשיפה לאור אולטרא סגול. אובה microirradiation, כשיטה מיקרוסקופיים, מייצג כלי ניסיוני עבור הלומדים נזק לדנ א בתאים חיים בודדים. Microirradiation שימש לראשונה, לפני 40 שנה על מנת לחשוף את הארגון של כרומוזום אזורים4,5. טכניקה זו תלויה מאוד גם את המאפיינים הפונקציונליים של מיקרוסקופ קונפוקלי או את מגבלות טכניות של nanoscopy מודרני. לזירוז DNA נגעים, תאים יכול להיות presensitized על ידי 5′ bromodeoxyuridine (BrdU) או Hoechst 33342 לפני הקרנת UV. . Bártová et al. 6 שתואר קודם לכן השלב presensitization, לאחרונה אנו ממוטב טכניקה זו microirradiation כדי למנוע מוות של תאים, או אפופטוזיס. לדוגמה, השימוש של UV 405 ננומטר לייזר (ללא Hoechst 33342 presensitization) מוביל תנאי הגיוס של 53BP1-חיובית כפולה-strand מעברי (DSBs) על חשבון הדימרים פירימידין cyclobutane (CPDs). מצד שני, צעדים presensitization בשילוב עם UV microirradiation לגרום רמות גבוהות מאוד של CPDs ו- DSBs בו זמנית7,8. מתודולוגיה זו קשה להחיל על המחקר של נתיב יחיד של תיקון דנ א.
עם microirradiation, זה אפשרי לנתח חלבון גיוס, קינטיקה, ואינטראקציה -נגעים DNA בתאים חיים. דוגמה של שיטה זו פורסם ע י Luijsterburg. et al. 9 1β חלבון הטרוכרומטין, ואנחנו לאחרונה הראה לראשונה כי הגורם pluripotency Oct4, חלבון הקשורים עם גופים Cajal, coilin, גייסו ל UV-induced DNA נגעים6,10. קינטיקה חלבון-נגעים DNA ניתן גם יהיה ללמוד באמצעות FRAP (קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר Photobleaching)11,12,13 או דאגה טכניקות (קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה)14 ,15. שיטות אלה יש פוטנציאל לחשיפת דיפוזיה פשוטה של חלבונים DNA נגעים או אינטראקציות חלבון חלבון. כלי שימושי עבור אפיון נוסף של חלבונים הוא FLIM (קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ) או השילוב שלו עם סריג טכנולוגיה (סריג-FLIM)16. שיטות אלה מאפשרות חקר תהליכים בחיי תאים stably או transiently לבטא את החלבון עניין שתייגת על ידי מולקולה פלורסנט17. כאן מוצגת דוגמה של דעיכה מעריכית הזמן (τ) חלבון p53 מתויג GFP והשותף שלה אינטראקציה, מתויג mCherry 53BP1, משחק תפקיד חשוב ב- DNA נזק תגובה18,19 . Τ פרמטר, משך fluorochrome שסופקו על-ידי חישובים FLIM, הוא ספציפי צבע נתון פלורסצנטיות, יכולותיו איגוד של הסביבה התאית. לכן, בשיטה זו יכול להראות לנו הבחנות בין חלבון subpopulations, יכולותיהם איגוד ומאפיינים הפונקציונלית שלהם לאחר, לדוגמה, נזק לדנ א.
. הנה, חלוקה לרמות גישות מתודולוגיים של טכניקות מתקדמות מיקרוסקופ המשמש במעבדה שלנו ללמוד חלבון וספציפיות בזמן הגיוס, קינטיקה, דיפוזיה, אינטראקציות חלבון-חלבון באתר של כרומטין microirradiated מוצג. המתודולוגיה צעד אחר צעד את תנאי הגיוס של נגעים מקומיים DNA בתאים חיים, תיאור של מתודולוגיות שימושי עבור מחקרים של ה-DNA נזק-אירועים הקשורים ב המושרה מקומית נגעים DNA הנגרם על ידי לייזרים UV הינם מסופקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות במיקרוסקופ מייצגים כלים בסיסיים במעבדות מחקר. כאן, תיאור קצר של השיטות המחקר של חלבון גיוס והוא מוצג קינטיקה ב DNA נגעים. במיוחד שהזכרנו ניסיוננו ניסויים בשדה של microirradiation המקומי של תאים חיים, נדון המחקר של חלבון קינטיקה על ידי האינטראקציה FRAP, חלבון ב DNA נגעים על ידי מקבל-הלבנת סריג<sup …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות מענק של הרפובליקה הצ’כית, פרוייקט P302-12-G157. ניסויים נתמכו גם-תוכנית CZ09 ‘ מחקר צ’כית-נורווגית, אשר מפוקח על ידי קרנות נורבגי, ועל ידי משרד החינוך, הנוער והספורט של הרפובליקה הצ’כית (להעניק את המספר: 7F14369).
Materials
| Cell cultivation | |||
| HeLa | ATCC | CCL-2TM | |
| ES-D3 [D3] | ATCC | CRL-11632TM | |
| HeLa -Fucci cells | http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html | ||
| DMEM | PAN-Biotech | P03-0710 | |
| DMEM high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SV30180.03 | |
| ES Cell FBS | Gibco | 16141-079 | |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-035 | |
| mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) | Merck Millipore | ESG1107 | |
| MTG (1-Thioglycerol) | Sigma-Aldrich | M6145-25ML | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biosera | XC-A4122/100 | |
| Trypsin – EDTA | Biosera | XC-T1717/100 | dilute with 1 × PBS in ratio 1:6 |
| Nunclon cell culture dishes | Sigma-Aldrich | P7866 | cultivation of mESCs D3 cells |
| µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 | Ibidi GmbH | 81166 | microscopic dish |
| 0.2% Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | dilute in destille water and autoclaved |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell transfection | |||
| GFP-p53 plasmid | Addgene | 12091 | |
| mCherry-PCNA plasmid | generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt | ||
| mCherry-53BP1 plasmid | Addgene | 19835 | |
| Metafecetene | Biontex Laboratories GmbH | T020–2.0 | |
| 10 × PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water |
| 5-bromo-2’-deoxy-uridine | Sigma-Aldrich | 11296736001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscopy | |||
| Microscope Leica TCS SP5 | Leica Microsystems | ||
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| White-light laser | Leica Microsystems | ||
| 355-nm laser | Coherent Inc. | laser power 80 mW | |
| 405-nm laser | Leica Microsystems | laser power 50 mW | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunofluorescence staining | |||
| Coverslip | VWR International Ltd | 631-1580 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Triton X100 | MP Biomedicals | 2194854 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 53BP1 | Abcam | ab21083 | primary antibody |
| AlexaFluore 647 | Thermo Fisher Scientific | A27040 | secondary antibody |
| Vectashield | Vector Laboratories Ltd | H-1000 | mounting medium |
Riferimenti
- Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
- Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
- Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
- Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
- Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
- Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
- Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
- Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
- Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
- Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
- Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
- Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
- Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
- Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
- Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
- Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
- Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
- Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
- Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
- Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
- Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
- Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
- Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
- Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
- Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
- Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
- Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
- Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).
